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Princípio de teste

Este kit é baseado na tecnologia ELISA de competição indireta.Os poços de microtitulação são revestidos com antígeno de acoplamento.flumequinaresíduo na amostra compete com o antígeno revestido na placa de microtitulação pelo anticorpo.Após a adição de anti-anticorpo marcado com enzima, o substrato TMB é usado para mostrar a cor.A absorvância da amostra está negativamente relacionada com a tetraciclina que reside nela, depois de comparar com a curva padrão, multiplicada pelo múltiplo de diluição, a quantidade de resíduos de flumequina na amostra pode ser calculada.

Formulários

Este kit pode ser utilizado em análises quantitativas e qualitativas de resíduo de flumequina em mel.

reações cruzadas

Flumequina …………………..……………………… 100%

Materiais requisitados

Equipamentos

┅┅Espectrofotômetro de placa de microtitulação (450nm/630nm)

┅┅Homogenizador ou estômago

┅┅Shaker

┅┅Vortex mixer

┅┅Centrífuga

┅┅Balanço analítico (indutância: 0,01g)

┅┅Pipeta graduada: 15ml

┅┅Pumpeta de borracha

┅┅Tubo de centrífuga de poliestireno: 15ml, 50ml

┅┅Tubo de ensaio de vidro: 10ml

┅┅Micropipetas: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,

250ml -multipipeta

Reagentes

┅┅n-hexano(AR)

┅┅Cloreto de metileno (AR)

┅┅Acetonitrila(AR)

┅┅Água deionizada

----- Ácido clorídrico concentrado (AR)

Componentes do kit

● Placa de microtitulação com 96 poços revestidos com antígeno

● Soluções padrão (6 frascos×1ml/frasco)

0ppb, 0,3ppb, 1,2ppb, 4,8ppb, 19,2ppb, 76,8ppb

● Controle padrão de alta concentração:(1ml/frasco)

………………………………………………......100ppb

● Conjugado enzimático 12ml………………………... tampa vermelha

● Solução de anticorpo 7ml …………..……..….…..tampa verde

● Solução A 7ml……..…………………..………..tampa branca

● Solução B 7ml …………….…………..………… tampa vermelha

● Solução Stop 7ml ……………………..………tampa amarela

● Solução de lavagem 20XConcentrada 40ml

………………………………………..…..tampa transparente

●Solução de extração 2X 50ml………………...… tampa azul

Preparação de Reagentes

7.1 Amostra de mel

Solução 1: solução de ácido clorídrico 0,2 M

Peso 41,5ml Ácido clorídrico concentrado, diluir com água deionizada para 500 ml.

Solução 2: solução de lavagem

Diluir a solução de lavagem concentrada com água deionizada na proporção de volume de 1:19, que será utilizada para a lavagem das placas.a solução diluída pode ser armazenada a 4 ℃ por 1 mês.

Solução3: solução de extração

Diluir a solução de extração concentrada 2× com água deionizada na proporção de volume de 1:1 (ou conforme a necessidade), que será utilizada para extração da amostra.Esta solução diluída pode ser conservada por 1 mês a 4℃.

Preparações de amostras

8.1 Aviso e precauções para os usuários antes da operação

(a) Por favor, use pontas únicas no processo de experimento e troque as pontas quando absorver um reagente diferente.

(b) Certifique-se de que todos os instrumentos experimentais estejam limpos, caso contrário, afetará o resultado do ensaio.

8.2amostra de mel

----- Pesar 2g±0,05g de amostra de mel em um tubo de centrífuga de poliestireno de 50ml,

-----Adicione 2ml de solução de ácido clorídrico 0,2 M (Solução 1), vórtice para misturar completamente, depois adicione 8ml de cloreto de metileno, agite com agitador por 5min para dissolver completamente;

-----Centrifugue por 10 min, pelo menos 3000g em temperatura ambiente (20-25℃);

-----Remova a fase sobrenadante, leve 2 ml da solução orgânica do substrato para um tubo de vidro de 10 ml. Seque o subestado em banho-maria com fluxo de nitrogênio (50-60 ℃)

-----Adicione 1 ml de n-hexano, vortex por 30s, então adicione 1ml de solução de extração (solução 3), vortex novamente por 1min.Centrifugue por 5min, pelo menos 3000g em temperatura ambiente (20-25℃);

-----Remover a fase sobrenadante, retirar 50ml para dosagem;

9. Processo de ensaio

9.1 Aviso antes do ensaio

9.1.1 Certifique-se de que todos os reagentes e micropoços estejam à temperatura ambiente (20-25℃).

9.1.2 Devolva todos os demais reagentes a 2-8℃ imediatamente após o uso.

9.1.3 A lavagem correta dos micropoços é uma etapa importante no processo de ensaio;é o fator vital para a repetitividade da análise ELISA.

9.1.4 Evite a luz e cubra os micropoços durante a incubação.

9.2 Etapas do ensaio

9.2.1 Retire todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25 ℃) por mais de 30 minutos, homogeneize antes de usar.

9.2.2 Retire os micropoços necessários e retorne o restante para o saco zip-lock a 2-8℃ imediatamente.

9.2.3 A solução de lavagem diluída deve ser reaquecida à temperatura ambiente antes do uso.

9.2.4Número:Numere cada posição do micropoço e todos os padrões e amostras devem ser executados em duplicado.Registre as posições dos padrões e amostras.

9.2.5Adicionar solução/amostra padrão:Adicione 50 µl de solução padrão ou amostra preparada aos poços correspondentes.Adicione 50 µl de solução de anticorpo.Misture suavemente agitando a placa manualmente e incube por 30 minutos a 25 ℃ com tampa.

9.2.6Lavagem:Remova a tampa com cuidado e limpe o líquido dos poços e enxágue os micropoços com 250 µl de solução de lavagem diluída (solução 2) em intervalos de 10 segundos por 4-5 vezes.Absorver a água residual com papel absorvente (o resto da bolha de ar pode ser eliminado com ponta não utilizada).

9.2.8.Conjugado enzimático:Adicione 100ml de solução de conjugado enzimático a cada poço, misture suavemente agitando a placa manualmente e incube por 30 minutos a 25 ℃ com tampa.Repita a etapa de lavagem novamente.

9.2.8Coloração:Adicione 50µl da solução A e 50µl da solução B a cada poço.Misture suavemente agitando a placa manualmente e incube por 15 min a 25 ℃ com tampa (consulte 12.8).

9.2.9Medir:Adicione 50 µl da solução de paragem a cada poço.Misture suavemente agitando a placa manualmente e meça a absorbância a 450 nm contra um branco de ar (sugerimos medir com o comprimento de onda duplo de 450/630 nm. Leia o resultado dentro de 5 minutos após a adição da solução de parada.) (Também podemos medir pela visão sem solução de parada em curto do instrumento ELIASA)

Resultados

10.1 Absorvância percentual

Os valores médios dos valores de absorbância obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorbância do primeiro padrão (padrão zero) e multiplicados por 100%.O padrão zero é assim igualado a 100% e os valores de absorbância são expressos em porcentagens.

Absorvância (%) = B/B0 ×100%

B ——padrão de absorbância (ou amostra)

B0 ——absorvância padrão zero

10.2 Curva Padrão

Para desenhar uma curva padrão: Tome o valor de absorbância dos padrões como eixo y, semi logarítmico da concentração da solução padrão de flumequina (ppb) como eixo x.

--- OflumequinaA concentração de cada amostra (ppb), que pode ser lida na curva de calibração, é multiplicada pelo múltiplo de diluição correspondente de cada amostra seguida, e a concentração real da amostra é obtida.

Para redução de dados dos kits ELISA, foi desenvolvido um software especial, que pode ser fornecido mediante solicitação.

11. Sensibilidade, exatidão e precisão

Sensibilidade do teste：0,3 ppb

Mel Fator de diluição da amostra: 2

Limite de detecção

Amostra de mel------------------------------------------------ -1ppb

Precisão

Amostra de mel --------------------------------------------- 90±20 %

Precisão

O coeficiente de variação do kit ELISA é inferior a 10%.

12. Aviso

12.1 Os valores médios dos valores de absorbância obtidos para os padrões e as amostras serão reduzidos se os reagentes e amostras não forem regulados à temperatura ambiente (20-25℃).

12.2 Não permita que os micropoços sequem entre as etapas para evitar repetição sem sucesso e opere a próxima etapa imediatamente após bater no suporte de micropoços.

12.3.Homogeneize cada reagente antes de usar.

12.4.Mantenha sua pele longe da solução de parada, pois é o 2M H₂SO₄solução.

12.5 Não utilize os kits desatualizados.Não troque os reagentes de lotes diferentes, pois isso diminuirá a sensibilidade.

12.6 Condição de armazenamento:

Mantenha os kits ELISA em 2-8 ℃, não congele.Selar as placas de micropoços de descanso Evite a luz direta do sol durante todas as incubações.Recomenda-se cobrir as placas de microtitulação.

12.7 Indicações de mau funcionamento dos reagentes:

A solução de substrato deve ser abandonada se mudar de cor.

Os reagentes podem ficar ruins se o valor de absorbância (450/630nm) do padrão zero for menor que 0,5 (A450nm＜0,5).

12.8 A reação de coloração precisa de 15 minutos após a adição da Solução A e da Solução B. E você pode prolongar os intervalos de tempo de incubação de 20 minutos para mais se a cor for muito clara para ser determinada.Nunca exceda 25min, pelo contrário, encurte o tempo de incubação adequadamente.

12.9 A temperatura de reação ideal é 25℃.Temperaturas mais altas ou mais baixas levarão a mudanças nos valores de sensibilidade e absorbância.

13. Armazenamento

Condição de armazenamento: 2-8 ℃.

Período de armazenamento: 12 meses.