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Principio de prueba

Este kit se basa en la tecnología ELISA de competencia indirecta.Los pocillos de microtitulación están recubiertos con antígeno de acoplamiento.flumequinael residuo en la muestra compite con el antígeno recubierto en la placa de microtitulación por el anticuerpo.Después de la adición del anti-anticuerpo marcado con enzima, se usa sustrato TMB para mostrar el color.La absorbancia de la muestra está negativamente relacionada con la tetraciclina que reside en ella, después de compararla con la curva estándar, multiplicada por el múltiplo de dilución, se puede calcular la cantidad de residuos de flumequina en la muestra.

Aplicaciones

Este kit se puede utilizar en el análisis cuantitativo y cualitativo de residuos de flumequina en la miel.

Reacciones cruzadas

Flumequina …………………..………………………… 100%

Materiales necesarios

Equipos

┅┅Espectrofotómetro de placas de microtitulación (450nm/630nm)

┅┅Homogeneizador o Stomacher

┅┅Agitador

┅┅Agitador vórtex

┅┅Centrífuga

┅┅Balanza analítica (inductancia: 0,01g)

┅┅Pipeta graduada: 15ml

┅┅Tubo de pipeta de goma

┅┅Tubo de centrífuga de poliestireno: 15ml, 50ml

┅┅Tubo de ensayo de vidrio: 10ml

┅┅Micropipetas: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,

250ml -multipipeta

reactivos

┅┅n-hexano (AR)

┅┅Cloruro de metileno (AR)

┅┅Acetonitrilo (AR)

┅┅Agua desionizada

-----Ácido clorhídrico concentrado (AR)

Componentes del equipo

● Placa de microtitulación con 96 pocillos recubiertos con antígeno

● Soluciones estándar (6 botellas × 1 ml/botella)

0 ppb, 0,3 ppb, 1,2 ppb, 4,8 ppb, 19,2 ppb, 76,8 ppb

● Control estándar de alta concentración: (1ml/botella)

………………………………………………………………100ppb

● Enzima conjugada 12ml…………………………... tapa roja

● Solución de anticuerpos 7ml …………..……..….…..tapa verde

● Solución A 7ml……..……………………..…………..tapa blanca

● Solución B 7ml …………….…………..………… tapa roja

● Solución de parada 7ml …………………..…………tapa amarilla

● 20X Solución de lavado concentrada 40ml

……………………………………..…..tapa transparente

● Solución de extracción 2X 50ml………………...… tapa azul

Preparación de reactivos

7.1 Muestra de miel

Solución 1: solución de ácido clorhídrico 0,2 M

Peso 41,5 ml Ácido clorhídrico concentrado, diluir con agua desionizada a 500 ml.

Solución 2: solución de lavado

Diluya la solución de lavado concentrada con agua desionizada en la proporción de volumen de 1:19, que se utilizará para lavar las placas.la solución diluida se puede almacenar a 4 ℃ durante 1 mes.

Solución3: solución de extracción

Diluya la solución de extracción concentrada 2x con agua desionizada en una proporción de volumen de 1:1 (o según los requisitos), que se utilizará para la extracción de la muestra.Esta solución diluida se puede conservar durante 1 mes a 4℃.

Preparaciones de muestra

8.1 Aviso y precauciones para los usuarios antes de la operación

(a) Utilice puntas únicas en el proceso del experimento y cambie las puntas cuando absorba un reactivo diferente.

(b) Asegúrese de que todos los instrumentos experimentales estén limpios, de lo contrario afectará el resultado del ensayo.

8.2muestra de miel

----- Pese 2 g ± 0,05 g de muestra de miel en un tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml,

-----Agregue 2 ml de solución de ácido clorhídrico 0,2 M (Solución 1), agite para mezclar completamente, luego agregue 8 ml de cloruro de metileno, agite con un agitador durante 5 minutos para disolver completamente;

-----Centrifugar durante 10 min, al menos 3000 g a temperatura ambiente (20-25 ℃);

-----Retire la fase sobrenadante, lleve 2 ml de la solución orgánica del sustrato a un tubo de vidrio de 10 ml. Seque el sustrato bajo un baño de agua con flujo de nitrógeno (50-60 ℃)

-----Agregue 1 ml de n-hexano, vórtice durante 30 s, luego agregue 1 ml de solución de extracción (solución 3), vórtice nuevamente durante 1 minuto.Centrifugar durante 5 min, al menos 3000 g a temperatura ambiente (20-25 ℃);

-----Eliminar la fase sobrenadante, tomar 50ml para ensayo;

9. Proceso de ensayo

9.1 Aviso antes del ensayo

9.1.1 Asegúrese de que todos los reactivos y micropocillos estén a temperatura ambiente (20-25 ℃).

9.1.2 Regrese todos los demás reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de usarlos.

9.1.3 El lavado correcto de los micropocillos es un paso importante en el proceso de ensayo;es el factor vital para la repetitividad del análisis ELISA.

9.1.4 Evite la luz y cubra los micropocillos durante la incubación.

9.2 Pasos del ensayo

9.2.1 Retire todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante más de 30 minutos, homogeneícelos antes de usarlos.

9.2.2 Saque los micropocillos necesarios y devuelva el resto a la bolsa con cierre hermético a 2-8 ℃ inmediatamente.

9.2.3 La solución de lavado diluida debe volver a calentarse a temperatura ambiente antes de su uso.

9.2.4Número:Numere todas las posiciones de los micropocillos y todos los estándares y muestras deben analizarse por duplicado.Registre las posiciones de los estándares y las muestras.

9.2.5Agregar solución estándar/muestra:Agregue 50 µl de solución estándar o muestra preparada a los pocillos correspondientes.Agregue 50 µl de solución de anticuerpos.Mezcle suavemente agitando la placa manualmente e incube durante 30 min a 25 ℃ con tapa.

9.2.6Lavar:Retire la tapa con cuidado y extraiga el líquido de los pocillos y enjuague los micropocillos con 250 µl de solución de lavado diluida (solución 2) a intervalos de 10 s durante 4 o 5 veces.Absorba el agua residual con papel absorbente (el resto de burbujas de aire se puede eliminar con una punta sin usar).

9.2.8.Conjugado enzimático:Agregue 100 ml de solución de conjugado enzimático a cada pozo, mezcle suavemente agitando la placa manualmente e incube durante 30 minutos a 25 ℃ con tapa.Repita el paso de lavado de nuevo.

9.2.8Coloración:Agregue 50 µl de solución A y 50 µl de solución B a cada pocillo.Mezclar suavemente agitando la placa manualmente e incubar durante 15 min a 25 ℃ con tapa (ver 12.8).

9.2.9Medida:Agregue 50 µl de la solución de parada a cada pocillo.Mezcle suavemente agitando la placa manualmente y mida la absorbancia a 450 nm contra un blanco de aire (se sugiere medir con la longitud de onda dual de 450/630 nm. Lea el resultado dentro de los 5 minutos posteriores a la adición de la solución de parada). (También podemos medir a simple vista sin solución de parada en resumen del instrumento ELIASA)

Resultados

10.1 Porcentaje de absorbancia

Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para los estándares y las muestras se dividen por el valor de absorbancia del primer estándar (estándar cero) y se multiplican por 100%.El estándar cero se hace así igual al 100% y los valores de absorbancia se expresan en porcentajes.

Absorbancia (%) = B/B0 ×100%

B ——estándar de absorbancia (o muestra)

B0 ——estándar cero de absorbancia

10.2 Curva estándar

Para dibujar una curva estándar: Tome el valor de absorbancia de los estándares como eje y, semilogarítmico de la concentración de la solución estándar de flumequina (ppb) como eje x.

--- ÉlflumequinaLa concentración de cada muestra (ppb), que se puede leer en la curva de calibración, se multiplica por el múltiplo de dilución correspondiente de cada muestra seguida, y se obtiene la concentración real de la muestra.

Para la reducción de datos de los kits ELISA, se ha desarrollado un software especial, que se puede proporcionar a pedido.

11. Sensibilidad, exactitud y precisión

Prueba de sensibilidad：0.3ppb

Factor de dilución de la muestra de miel: 2

Límite de detección

Muestra de miel------------------------------------------------ -1ppb

Precisión

Muestra de miel --------------------------------------------- 90±20 %

Precisión

El coeficiente de variación del kit ELISA es inferior al 10%.

12. Aviso

12.1 Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para los estándares y las muestras se reducirán si los reactivos y las muestras no se han regulado a temperatura ambiente (20-25 ℃).

12.2 No permita que los micropocillos se sequen entre pasos para evitar repeticiones sin éxito y opere el siguiente paso inmediatamente después de tocar el soporte de micropocillos.

12.3.Homogeneizar cada reactivo antes de usar.

12.4.Mantenga su piel alejada de la solución de parada porque es el 2M H₂SO₄solución.

12.5 No utilice los kits vencidos.No intercambie los reactivos de diferentes lotes, ya que disminuirá la sensibilidad.

12.6 Condiciones de almacenamiento:

Mantenga los kits ELISA a 2-8 ℃, no los congele.Selle las placas de micropocillos restantes. Evite la luz directa del sol durante todas las incubaciones.Se recomienda cubrir las placas de microtitulación.

12.7 Indicaciones de deterioro de los reactivos:

La solución de sustrato debe abandonarse si cambia de color.

Los reactivos pueden estropearse si el valor de absorbancia (450/630nm) del estándar cero es inferior a 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 La reacción de coloración necesita 15 minutos después de agregar la Solución A y la Solución B. Y puede prolongar los rangos de tiempo de incubación de 20 minutos a más si el color es demasiado claro para determinarlo.Nunca exceda los 25min, por el contrario, acorte el tiempo de incubación adecuadamente.

12.9 La temperatura de reacción óptima es de 25 ℃.Una temperatura más alta o más baja conducirá a cambios en los valores de sensibilidad y absorbancia.

13. Almacenamiento

Condiciones de almacenamiento: 2-8 ℃.

Período de almacenamiento: 12 meses.