Kit de inmunoensayo enzimático competitivo para análisis cuantitativo de tilosina
Kit de inmunoensayo enzimático competitivo para
Análisis cuantitativo detilosina
1. Antecedentes
tilosinaes un antibiótico macrólido, que se aplica principalmente como antibacteriano y antimicoplasma.Se han establecido LMR estrictos ya que este medicamento puede provocar efectos secundarios graves en ciertos grupos.
Este kit es un nuevo producto basado en la tecnología ELISA, que es rápido, fácil, preciso y sensible en comparación con el análisis instrumental común y solo necesita 1,5 horas en una sola operación, puede minimizar considerablemente el error de operación y la intensidad del trabajo.
2. Principio de prueba
Este kit se basa en la tecnología ELISA de competencia indirecta.Los pocillos de microtitulación están recubiertos con antígeno de acoplamiento.El residuo de tilosina en la muestra compite con el antígeno que recubre la placa de microtitulación por el anticuerpo.Después de la adición del anti-anticuerpo marcado con enzima, se usa sustrato TMB para mostrar el color.La absorbancia de la muestra está negativamente relacionada con la tilosina que reside en ella, después de compararla con la curva estándar, multiplicada por el factor de dilución, se puede calcular la cantidad de residuos de tilosina en la muestra.
3. Aplicaciones
Este kit se puede utilizar en el análisis cuantitativo y cualitativo de residuos de tilosina en tejido animal (pollo, cerdo, pato) y leche, miel, huevo, etc.
4. Reacciones cruzadas
Tilosina……………………………………………………..100%
Tilmicosina………………………………………………<2%
5. Materiales necesarios
5.1 Equipos:
----Espectrofotómetro de placa de microtitulación (450nm/630nm)
----Evaporador rotatorio o instrumentos de secado de nitrógeno
----homogeneizador
----Criba vibradora
----Centrífugo
----Balanza analítica (inductancia: 0.01g)
----Pipeta graduada: 10ml
---- Bulbo de pipeta de goma
---- Matraz aforado: 10ml
----Tubos de centrífuga de poliestireno: 50ml
----Micropipetas: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipeta
5.2 Reactivos:
----Hidróxido de sodio (NaOH, AR)
----Bicarbonato de sodio (NaHCO3,ARKANSAS)
---- Carbonato de sodio (NaCO3, AR)
----Ácido tricloroacético (AR)
---- Acetonitrilo (AR)
---- Acetato de etilo (AR)
┅┅n-hexano (AR)
----Agua desionizada
6. Componentes del equipo
l Placa de microtitulación con 96 pocillos recubiertos con antígeno
l Soluciones estándar (5 botellas, 1ml/botella)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Control estándar de adición: (1ml/botella)1 ppm
l Conjugado enzimático 1ml……………..…..…tapa roja
l Solución de anticuerpos 7ml……………….……tapa verde
l Solución A 7ml…………………….….……tapa blanca
l Solución B 7ml...………………………………..tapa roja
l Solución de parada 7ml.……………….……….tapa amarilla
l 20×solución de lavado concentrada 40ml
………………………………..…tapa transparente
l 4×solución de extracción concentrada 50ml
……………………………………………….gorra azul
7. preparación de reactivos:
Solución 1:Solución de NaOH de 0,1 mol/L
Pesar 0,4 g de NaOH en 100 ml de agua desionizada y mezclar completamente.
Solución 2: 1 mol/L de solución de NaOH
Pesar 4 g de NaOH en 100 ml de agua desionizada y mezclar completamente.
Solución 3: sal tampón de carbonato
Solución1: 0,2 M PB
Disolver 51,6 g de Na2HPO4·12H2O, 8,7 g de NaH2PO4·2H2O con agua desionizada y diluir a 1000ml.
Solución2: Solución de extracción
Diluya la solución de extracción concentrada 2x con agua desionizada en una proporción de volumen de 1:1(por ejemplo, 10 ml de solución de extracción 2x + 10 ml de agua desionizada), que se utilizará para la extracción de muestras,esta solución se puede almacenar a 4 ℃ durante 1 mes.
Solución3: solución de lavado
Diluya la solución de lavado concentrada 20x con agua desionizada en una proporción de volumen de 1:19(por ejemplo, 5 ml de solución de lavado 20× + 95 ml de agua desionizada), que se utilizará para lavar los platos.Esta solución se puede almacenar a 4 ℃ durante 1 mes.
8. Preparaciones de muestras
8.1 Aviso y precauciones antes de la operación:
(a) Utilice puntas únicas en el proceso del experimento y cambie las puntas cuando absorba un reactivo diferente.
(b) Asegúrese de que todos los instrumentos estén limpios.
(c) Mantenga la muestra de tejido congelada.
(d) La muestra preparada debe usarse para el ensayo de inmediato.
8.2 Tejido animal (pollo, cerdo, etc.)
----Homogeneizar la muestra con homogeneizador;
---- Tome 2,0 ± 0,05 g de homogeneizado en un tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml;agregue 2ml de 0.2M PB (solución1), agite para disolver y luego agregue 8 ml de acetato de etilo y agite vigorosamente durante 3 minutos;
----Centrífuga para separación: 3000g / temperatura ambiente / 5min.
---- Transfiera 4 ml de la fase orgánica sobrenadante a un tubo de vidrio de 10 ml, seque con un baño de agua a 50-60 ℃ bajo una corriente de gas nitrógeno;
---- Disuelva los restos secos con 1 ml de n-hexano, agite en vórtice durante 30 segundos para disolver y luego agregue 1 ml de solución de extracción (solución2), vórtice durante 1 min.centrífuga para separación: 3000g / temperatura ambiente / 5min
----Eliminar la fase de n-hexano sobrenadante;tome 50 μl de la fase acuosa del sustrato para el ensayo.
Factor de dilución: 1
8.2 Leche
----Tome 100 μl de muestra de leche cruda, mezcle con 900 μl de solución de extracción (solución2), y mezcle completamente.
----Tome 50 μl de la solución preparada para el ensayo.
Factor de dilución: 10
9. Proceso de ensayo
9.1 Aviso antes del ensayo
9.1.1Asegúrese de que todos los reactivos y micropocillos estén a temperatura ambiente (20-25 ℃).
9.1.2Devuelva todos los demás reactivos a 2-8℃inmediatamente después de su uso.
9.1.3Lavar correctamente los micropocillos es un paso importante en el proceso de ensayo;es el factor vital para la reproducibilidad del análisis ELISA.
9.1.4 Aanule la luz y cubra los micropocillos durante la incubación.
9.2 Pasos del ensayo
9.2.1 Saque todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante más de 30 minutos, agítelos suavemente antes de usarlos.
9.2.2 Saque los micropocillos necesarios y devuelva el resto a la bolsa con cierre hermético a 2-8 ℃ inmediatamente.
9.2.3 La solución de lavado diluida debe volver a calentarse a temperatura ambiente antes de su uso.
9.2.4Número:Numere todas las posiciones de los micropocillos y todos los estándares y muestras deben procesarse por duplicado.Registre las posiciones de los estándares y las muestras.
9.2.5Add solución estándar/muestra y solución de anticuerpos: Añadir 50 µl de solución estándar ((kit proporcionado)) o muestra preparada a los pocillos correspondientes.Añadir 50 µl de solución de anticuerpos (kit proporcionado).Mezcle suavemente agitando la placa manualmente e incube durante 30 min a 37 ℃ con tapa.
9.2.6Lavar: Quite la tapa con cuidado y extraiga el líquido de los pocillos y enjuague los micropocillos con 250 µl de solución de lavado diluida (solución3) a intervalos de 10 s durante 4-5 veces.Absorba el agua residual con papel absorbente (el resto de burbujas de aire se puede eliminar con una punta sin usar).
9.2.7Agregar enzima conjugada: Agregue 100 ml de solución de enzima conjugada (kit proporcionado) a cada pocillo, mezclar suavemente e incubar durante 30 min a 37 ℃ con tapa.Repita el paso de lavado de nuevo.
9.2.8Coloración: Añadir 50µl de solución A(kit proporcionado) y 50µl de solución B(kit proporcionado) a cada pozo.Mezclar suavemente e incubar durante 15 min a 37 ℃ con tapa.
9.2.9Medida: Agregue 50 µl de la solución de parada (kit proporcionado) a cada pozo.Mezcle suavemente y mida la absorbancia a 450 nm (se sugiere medir con la longitud de onda dual de 450/630 nm. Lea el resultado dentro de los 5 minutos posteriores a la adición de la solución de parada).
10. Resultados
10.1 Porcentaje de absorbancia
Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para los estándares y las muestras se dividen por el valor de absorbancia del primer estándar (estándar cero) y se multiplican por 100%.El estándar cero se hace así igual al 100% y los valores de absorbancia se expresan en porcentajes.
B
Absorbancia (%) = —— ×100%
B0
B ——estándar de absorbancia (o muestra)
B0 ——estándar cero de absorbancia
10.2 Curva estándar
----Para dibujar una curva estándar: Tome el valor de absorbancia de los estándares como eje y, semilogarítmico de la concentración de la solución estándar de tilosina (ppb) como eje x.
----La concentración de tilosina de cada muestra (ppb), que se puede leer en la curva de calibración, se multiplica por el factor de dilución correspondiente de cada muestra seguida y se obtiene la concentración real de la muestra.
Note por favor:
Se ha desarrollado un software especial para el análisis de datos, que se puede proporcionar a pedido.
11. Sensibilidad, exactitud y precisión
Sensibilidad de prueba:1.5ppb
Límite de detección:
Tejido animal………………………….………………1.5ppb Leche……………………………………………….....…..15ppb Precisión:
Tejido animal…………………………...…………80±15%
Leche……………………………………..………….……80±10%
Precisión:
El coeficiente de variación del kit ELISA es inferior al 10%.
12. Aviso
12.1 Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para los estándares y las muestras se reducirán si los reactivos y las muestras no se han regulado a temperatura ambiente (20-25 ℃).
12.2 No permita que los micropocillos se sequen entre pasos para evitar una reproducibilidad fallida y opere el siguiente paso inmediatamente después de tocar el soporte de micropocillos.
12.3 Agite suavemente cada reactivo antes de usarlo.
12.4 Mantenga su piel alejada de la solución de parada porque es 0.5MH2SO4solución.
12.5 No utilice los kits vencidos.No intercambie los reactivos de diferentes lotes, o de lo contrario disminuirá la sensibilidad.
12.6 Mantenga los kits ELISA a 2-8 ℃, no los congele.Selle las placas de micropocillos de descanso. Evite la luz directa del sol durante todas las incubaciones.Se recomienda cubrir las placas de microtitulación.
12.7 La solución de sustrato debe abandonarse si cambia de color.Los reactivos pueden estropearse si el valor de absorbancia (450/630nm) del estándar cero es inferior a 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 La reacción de coloración necesita 15 minutos después de agregar la solución A y la solución B. Y puede prolongar los rangos de tiempo de incubación a 20 minutos o más si el color es demasiado claro para determinarlo.Nunca exceda los 30min, al contrario, acorte adecuadamente el tiempo de incubación.
12.9 La temperatura de reacción óptima es 37 ℃.Una temperatura más alta o más baja conducirá a cambios en los valores de sensibilidad y absorbancia.
13. Almacenamiento
Condiciones de almacenamiento: 2-8 ℃.
Período de almacenamiento: 12 meses.
