Kit Immunoassay Enzyme farpaiseach airson mion-sgrùdadh cainneachdail air Tylosin
Kit Immunoassay Enzyme farpaiseach airson
Mion-sgrùdadh cainneachdail deTylosin
1. Cùl-fhiosrachadh
TylosinIs e antibiotic macrolide a th 'ann, a tha gu ìre mhòr air a chleachdadh mar antibacterial agus anti-mycoplasma.Cha deach MRLn teann a stèidheachadh oir dh’ fhaodadh an droga seo leantainn gu droch bhuaidh ann am buidhnean sònraichte.
Is e toradh ùr a th’ anns a ’phiseag seo stèidhichte air teicneòlas ELISA, a tha luath, furasta, ceart agus mothachail an taca ri mion-sgrùdadh ionnsramaid cumanta agus dìreach feumach air 1.5 uair ann an aon obrachadh, faodaidh e mearachd obrachaidh agus dian-obrach a lughdachadh gu mòr.
2. Prionnsabal Deuchainn
Tha am pasgan seo stèidhichte air teicneòlas ELISA farpaiseach neo-dhìreach.Tha na tobraichean microtiter air an còmhdach le antigen ceangail.Bidh fuigheall Tylosin san sampall a’ farpais ris an antigen còmhdaichte air a’ phlàta microtiter airson an antibody.Às deidh cuir a-steach enzyme leis an ainm anti-antibody, thathas a’ cleachdadh substrate TMB gus an dath a nochdadh.Tha droch bhuaidh aig gabhail ris an t-sampall ris an tylosin a tha a’ fuireach ann, às deidh coimeas a dhèanamh ris an Standard Curve, air iomadachadh leis a’ bhàillidh caolachaidh, faodar meud fuigheall tylosin san sampall a thomhas.
3. Iarrtasan
Faodar an uidheamachd seo a chleachdadh ann an sgrùdadh cainneachdail agus càileachdail air fuigheall tylosin ann an clò bheathaichean (cearc, muiceann, lachan) agus bainne, mil, ugh, msaa.
4. Tar-fhreagairt
Tylosin...........................................................................................
Tilmosin………………………………………………<2%
5. Stuthan a dhìth
5.1 Innealan:
---- Spectrophotometer plàta microtiter (450nm / 630nm)
---- ionnstramaidean evaporator rothlach no nitrigin
---- homogenizer
---- Shaker
---- Centrifuge
---- Cothromachadh anailis (inntrigeadh: 0.01g)
---- Pìob ceumnaichte: 10ml
---- bulb pìobaire rubair
---- Flasg toirteil: 10ml
---- Tiùban centrifuge polystyrene: 50ml
---- Micrippettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml - ioma-phìob
5.2 Ath-bheachdan:
----Sòidiam hydroxide (NaOH, AR)
---- Sodium bicarbonate (NaHCO3,AR)
---- sodium carbonate (NaCO3, AR)
---- aigéad trichloroacetic (AR)
---- Acetonitrile (AR)
---- Acetate ethyl (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
---- uisge deionized
6. Co-phàirtean Kit
l Plàta microtiter le 96 tobraichean còmhdaichte le antigen
l Fuasglaidhean àbhaisteach (5 botail, 1ml / botal)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Smachd àbhaisteach snìomh: (1ml / botal)1ppm
l Enzyme conjugate 1ml …………………..…cap dearg
l Fuasgladh antibody 7ml ……………….…… ceap uaine
l Fuasgladh A 7ml ……………………….…… ceap geal
l Fuasgladh B 7ml...…………………………..caip dearg
l Cuir stad air fuasgladh 7ml.……………….…….caip buidhe
l 20 × fuasgladh nighe tiugh 40ml
……………………………..…caip fhollaiseach
l 4 × fuasgladh às-tharraing cuimseach 50ml
……………………………………………….caip gorm
7. Ag ullachadh reactaran:
Fuasgladh 1:Fuasgladh 0.1mol/L NaOH
Cuidich 0.4g NaOH gu 100ml uisge deionized agus measgachadh gu tur.
Fuasgladh 2: fuasgladh 1mol/L NaOH
Cuidich 4g NaOH gu 100ml uisge deionized agus measgachadh gu tur.
Fuasgladh 3: salann bufair carbonate
Fuasgladh1: 0.2M PB
Fuasgail 51.6g de Na2HPO4·12 h2O, 8.7g de NaH2PO4·2h2O le uisge deionized agus caolaich gu 1000ml.
Fuasgladh2: Fuasgladh às-tharraing
Lùghdaich am fuasgladh às-tharraing tiugh 2 × le uisge deionized anns a’ cho-mheas tomhas-lìonaidh 1: 1 (me 10ml de fhuasgladh 2 × às-tharraing + 10ml de uisge deionized), a thèid a chleachdadh airson sampall às-tharraing,faodar am fuasgladh seo a stòradh aig 4 ℃ airson 1 mìos.
Fuasgladh3: Fuasgladh nighe
Lùghdaich am fuasgladh nighe tiugh 20 × le uisge deionized anns a ’cho-mheas tomhas-lìonaidh 1: 19 (me 5ml de fhuasgladh 20 × nighe + 95ml de uisge deionized), a thèid a chleachdadh airson na truinnsearan a nighe.Faodar am fuasgladh seo a stòradh aig 4 ℃ airson 1 mìos.
8. Sample Ullachaidhean
8.1 Sanas agus ro-chùram mus obraich thu:
(a) Feuch an cleachd thu molaidhean aon-uair ann am pròiseas deuchainn, agus atharraich na molaidhean nuair a ghabhas thu a-steach diofar imoibrí.
(b) Dèan cinnteach gu bheil a h-uile inneal glan.
(c) Cùm sampall clò ann an reothadh.
(d) Bu chòir sampall ullaichte a chleachdadh airson assay aig an aon àm.
8.2 Stuth bheathaichean (cearc, muiceann, msaa)
---- Homogenize an sampall le homogenizer;
---- Thoir 2.0 ± 0.05g de homogenate a-steach do phìob centrifuge polystyrene 50ml;cuir 2ml de 0.2M PB ris (fuasgladh1), crathadh gus a sgaoileadh, agus an uairsin cuir 8ml de ethyl acetate agus crathadh gu cruaidh airson 3 mionaidean;
---- Centrifuge airson dealachadh: 3000g / teòthachd àrainneachd / 5min.
---- Gluasad 4ml den ìre organach supernatant gu tiùb glainne 10ml, tioram le amar uisge 50-60 ℃ fo shruth gas nitrogen;
---- Fuasgail an còrr tioram le 1ml de n-hexane, vortex airson 30s gus a sgaoileadh, agus an uairsin cuir 1ml de fhuasgladh às-tharraing (fuasgladh2), vortex airson 1min.centrifuge airson dealachadh: 3000g / Ambient Teòthachd / 5min
---- Thoir air falbh an ìre supernatant n-hexane;Gabh 50 μl den ìre uisgeach substrate airson assay.
Factor dilution: 1
8.2 Bainne
---- Gabh 100 μl de shampall bainne amh, measgachadh le 900 μl de fhuasgladh às-tharraing (fuasgladh2), agus measgachadh gu tur.
---- Gabh 50 μl den fhuasgladh ullaichte airson assay.
Factor caolachaidh: 10
9. Pròiseas assay
9.1 Sanas ron assay
9.1.1Dèan cinnteach gu bheil na h-ath-bheachdan agus na microwells uile aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃).
9.1.2Thoir air ais na h-ath-bheachdan eile gu 2-8℃dìreach às deidh a chleachdadh.
9.1.3Tha a bhith a’ nighe nam microwells gu ceart na cheum cudromach ann am pròiseas assay;tha e na fheart deatamach do ath-riochdachadh mion-sgrùdadh ELISA.
9.1.4 Afalamh an solas agus còmhdaich na microwells aig àm goir.
9.2 Ceumannan Assay
9.2.1 Thoir a-mach na h-uile ath-bheachdan aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃) airson barrachd air 30 mionaid, crathadh gu socair mus cleachd thu iad.
9.2.2 Thoir a-mach na microwells a tha a dhìth agus till an còrr a-steach don bhaga glas-zip aig 2-8 ℃ sa bhad.
9.2.3 Bu chòir am fuasgladh nighe caolaichte a bhith air ath-bhlàthachadh gus a bhith aig teòthachd an t-seòmair mus tèid a chleachdadh.
9.2.4Àireamh:Bu chòir gach suidheachadh microwell agus gach inbhe agus sampall a bhith air an ruith ann an dùblachadh.Clàraich na h-inbhean agus suidheachadh sampall.
9.2.5Add fuasgladh àbhaisteach / sampall agus fuasgladh antibody: Cuir 50µl de fhuasgladh àbhaisteach ((kit air a thoirt seachad)) no sampall ullaichte gu tobraichean co-fhreagarrach.Cuir 50µl de fhuasgladh antibody ris (kit air a thoirt seachad).Meudaich gu socair le bhith a’ crathadh a’ phlàta le làimh agus goir airson 30 mionaid aig 37 ℃ le còmhdach.
9.2.6Nigh: Thoir air falbh an còmhdach gu socair agus glan an leaghan a-mach às na tobraichean agus nigh na microwells le fuasgladh nighe caolaichte 250µl (fuasgladh3) aig eadar-ama de 10s airson 4-5times.Gabh a-steach an uisge a tha air fhàgail le pàipear sùghaidh (faodar am builgean èadhair eile a chuir às le tip nach deach a chleachdadh).
9.2.7Cuir ris an enzyme conjugate: Cuir 100ml de fhuasgladh enzyme conjugate (kit air a thoirt seachad) gu gach tobar, measgachadh gu socair agus goir airson 30 mionaid aig 37 ℃ le còmhdach.Dèan a-rithist an ceum nighe a-rithist.
9.2.8Dathadh: Cuir 50µl de fhuasgladh A (kit air a thoirt seachad) agus 50µl de fhuasgladh B (kit air a thoirt seachad) do gach tobar.Meudaich gu socair agus goir airson 15 mionaidean aig 37 ℃ le còmhdach.
9.2.9Tomhais: Cuir 50µl den fhuasgladh stad (kit air a thoirt seachad) do gach tobar.Meudaich gu socair agus tomhas an sùghadh aig 450nm (Thathas a’ moladh tomhas leis an tonn-dùbailte 450/630nm. Leugh an toradh taobh a-staigh 5min às deidh dhut fuasgladh stad a chur ris).
10. Toraidhean
10.1 sa cheud sùghaidh
Tha luachan cuibheasach nan luachan sùghaidh a gheibhear airson na h-inbhean agus na sampallan air an roinn le luach sùghaidh a’ chiad ìre (inbhe neoni) agus air an iomadachadh le 100%.Mar sin tha an ìre neoni air a dhèanamh co-ionann ri 100% agus tha na luachan sùghaidh air an ainmeachadh ann an ceudadan.
B
Neo-làthaireachd (%) = —— × 100%
B0
B —— inbhe neo-làthaireachd (no sampall)
B0 —— inbhe neoni
10.2 Curve àbhaisteach
---- Gus lùb àbhaisteach a tharraing: Gabh luach sùghadh inbhean mar y-axis, leth-logarithmic de chruinneachadh fuasgladh inbhean tylosin (ppb) mar x-axis.
---- Tha an dùmhlachd tylosin de gach sampall (ppb), a ghabhas leughadh bhon lùb calibration, air iomadachadh leis a’ bhàillidh dilution co-fhreagarrach airson gach sampall a thèid a leantainn, agus gheibhear an fhìor chruinneachadh de shampall.
Thoir an aire:
chaidh bathar-bog sònraichte a leasachadh airson mion-sgrùdadh dàta, a dh'fhaodar a thoirt seachad ma thèid iarraidh.
11. Cugallachd, mionaideachd agus mionaideachd
Mothachadh deuchainn:1.5ppb
Crìochan lorgaidh:
Stuth beathach ………………………….…………… 1.5ppb Bainne ………………………………………………………..15ppb Cruinneas:
Stuth beathach …………………………...…………80±15%
Bainne………………………………..……….……80±10%
Cruinneas:
Tha co-èifeachd eadar-dhealachaidh an uidheamachd ELISA nas lugha na 10%.
12. Sanas
12.1 Thèid luachan cuibheasach nan luachan sùghaidh a gheibhear airson na h-inbhean agus na sampallan a lughdachadh mura h-eil na h-ath-bheachdan agus na sampallan air an riaghladh gu teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃).
12.2 Na leig le microwells tiormachadh eadar ceumannan gus ath-riochdachadh neo-shoirbheachail a sheachnadh agus obraich an ath cheum sa bhad às deidh dha tapadh air neach-gleidhidh microwells.
12.3 Crith gach reagent gu socair mus cleachd thu e.
12.4 Cùm do chraiceann air falbh bhon fhuasgladh stad oir tha e 0.5MH2SO4fuasgladh.
12.5 Na cleachd na goireasan as ùire.Na atharraich na h-ath-bheachdan ann an diofar batches, air neo fàgaidh e cugallachd.
12.6 Cùm na goireasan ELISA aig 2-8 ℃, na reothadh.Ròin truinnsearan microwell fois, Seachain solas dìreach rè gach goir.Thathas a 'moladh a bhith a' còmhdach nam plèanaichean microtiter.
12.7 Bu chòir fuasgladh substrate a thrèigsinn ma thionndaidheas e dathan.Faodaidh na h-ath-bheachdan tionndadh dona ma tha an luach sùghaidh (450/630nm) den inbhe neoni nas lugha na 0.5 (A450nm <0.5).
12.8 Feumaidh an ath-bhualadh dath 15 mionaidean às deidh fuasgladh A agus fuasgladh B a chur ris. Agus faodaidh tu na raointean ùine brosnachaidh a leudachadh gu 20 mionaid no barrachd ma tha an dath ro aotrom airson a dhearbhadh.Na bi a-riamh nas fhaide na 30 mionaid, air an làimh eile, giorraich an ùine goir gu ceart.
12.9 Is e an teòthachd ath-bhualadh as fheàrr 37 ℃.Bidh teòthachd nas àirde no nas ìsle a’ leantainn gu atharrachaidhean ann an luachan cugallachd agus sùghaidh.
13. Stòradh
Suidheachadh stòraidh: 2-8 ℃.
Ùine stòraidh: 12 mìosan.
