Bộ xét nghiệm miễn dịch enzyme cạnh tranh để phân tích định lượng Tylosin
Bộ xét nghiệm miễn dịch Enzyme cạnh tranh cho
Phân tích định lượng củatylosin
1. Bối cảnh
tylosinlà một loại kháng sinh macrolide, chủ yếu được sử dụng để kháng khuẩn và chống mycoplasma.MRL nghiêm ngặt đã được thiết lập vì loại thuốc này có thể dẫn đến tác dụng phụ nghiêm trọng ở một số nhóm nhất định.
Bộ kit này là một sản phẩm mới dựa trên công nghệ ELISA, nhanh chóng, dễ dàng, chính xác và nhạy cảm so với phân tích dụng cụ thông thường và chỉ cần 1,5 giờ cho một lần thao tác, nó có thể giảm thiểu đáng kể lỗi thao tác và cường độ làm việc.
2. Nguyên tắc kiểm tra
Bộ này dựa trên công nghệ ELISA cạnh tranh gián tiếp.Các giếng microtiter được phủ kháng nguyên ghép.Dư lượng tylosin trong mẫu cạnh tranh với kháng nguyên được phủ trên tấm microtiter để giành kháng thể.Sau khi bổ sung enzyme được đánh dấu kháng thể, chất nền TMB được sử dụng để hiển thị màu.Độ hấp thụ của mẫu tỷ lệ nghịch với tylosin cư trú trong đó, sau khi so sánh với Đường chuẩn, nhân với hệ số pha loãng, có thể tính được lượng dư lượng tylosin trong mẫu.
3. Ứng dụng
Bộ kit này có thể được sử dụng trong phân tích định lượng và định tính dư lượng tylosin trong mô động vật (gà, heo, vịt) và sữa, mật ong, trứng, v.v.
4. Phản ứng chéo
Tylosin………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………<2%
5. Vật liệu cần thiết
5.1 Trang thiết bị:
----Máy quang phổ tấm microtiter (450nm/630nm)
---- Thiết bị bay hơi quay hoặc dụng cụ sấy nitơ
---- máy đồng nhất
---- Máy lắc
---- Máy ly tâm
----Cân phân tích (độ tự cảm: 0,01g)
---- Pipet chia độ: 10ml
---- Bóng pipet cao su
---- Bình định mức: 10ml
---- Ống ly tâm Polystyrene: 50ml
---- Micropipet: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Thuốc thử:
----Natri hydroxit (NaOH, AR)
----Natri bicacbonat (NaHCO3,AR)
---- Natri cacbonat (NaCO3, AR)
---- Axit trichloroacetic (AR)
---- Axetonitril (AR)
----Etyl axetat (AR)
┅┅n-Hexan (AR)
----Nước khử ion
6. Thành phần bộ
l Tấm microtiter với 96 giếng được phủ kháng nguyên
l Dung dịch chuẩn (5 chai, 1ml/chai)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Kiểm soát tiêu chuẩn tăng vọt: (1ml/chai)1 phần triệu
l Enzyme liên hợp 1ml……………..…..…nắp đỏ
l Dung dịch kháng thể 7ml…………….……nắp xanh
l Dung dịch A 7ml…………………….….……nắp trắng
l Dung dịch B 7ml...………………………..nắp đỏ
l Stop solution 7ml.……………….……….nắp màu vàng
l Dung dịch rửa đậm đặc 20×40ml
…………………………………..…nắp trong suốt
l Dung dịch chiết cô đặc 4×50ml
……………………………………………….mũ lưỡi trai màu xanh
7. Chuẩn bị thuốc thử:
Giải pháp 1:Dung dịch NaOH 0,1mol/L
Cân 0,4g NaOH cho vào 100ml nước khử ion và trộn đều.
Giải pháp 2: Dung dịch NaOH 1mol/L
Cân 4g NaOH cho vào 100ml nước khử ion và trộn đều.
Giải pháp 3: Muối đệm cacbonat
Dung dịch1: 0,2 triệu PB
Hòa tan 51,6g Na2HPO4·12H2O, 8,7 gam NaOH2PO4·2H2O với nước khử ion và pha loãng thành 1000ml.
Dung dịch2: Dung dịch chiết xuất
Pha loãng dung dịch chiết cô đặc 2× với nước khử ion theo tỷ lệ thể tích 1:1(ví dụ: 10ml dung dịch chiết 2× + 10ml nước khử ion), sẽ được sử dụng để chiết xuất mẫu,dung dịch này có thể bảo quản ở 4℃ trong 1 tháng.
Dung dịch3: Dung dịch rửa
Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 20 × với nước khử ion theo tỷ lệ thể tích 1:19(ví dụ: 5ml dung dịch rửa 20 lần + 95ml nước khử ion), sẽ được sử dụng để rửa các tấm.Dung dịch này có thể bảo quản ở 4℃ trong 1 tháng.
8. Chuẩn bị mẫu
8.1 Lưu ý và biện pháp phòng ngừa trước khi vận hành:
(a) Vui lòng sử dụng các mẹo một lần trong quá trình thí nghiệm và thay đổi các mẹo khi hấp thụ các thuốc thử khác nhau.
(b) Đảm bảo rằng tất cả các dụng cụ đều sạch sẽ.
(c) Giữ mẫu mô ở trạng thái đông lạnh.
(d) Nên sử dụng mẫu đã chuẩn bị để xét nghiệm ngay lập tức.
8.2 Mô động vật (gà, lợn, v.v.)
---- Đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất;
----Lấy 2,0 ± 0,05g chất đồng nhất vào ống ly tâm polystyrene 50ml;thêm 2ml PB 0,2M (giải pháp1), lắc để hòa tan, sau đó thêm 8ml etyl axetat và lắc mạnh trong 3 phút;
---- Máy ly tâm để tách: 3000g / nhiệt độ môi trường / 5 phút.
---- Chuyển 4ml pha hữu cơ nổi trên bề mặt vào ống thủy tinh 10ml, làm khô bằng cách thủy 50-60℃ dưới dòng khí nitơ;
---- Hòa tan phần khô còn lại với 1ml n-hexan, xoáy trong 30 giây để hòa tan, sau đó thêm 1ml dung dịch chiết (giải pháp2), xoáy trong 1 phút.máy ly tâm để tách: 3000g / nhiệt độ môi trường / 5 phút
----Loại bỏ pha n-hexan nổi phía trên;lấy 50μl pha nước cơ chất để xét nghiệm.
Hệ số pha loãng: 1
8.2 Sữa
----Lấy 100μl mẫu sữa nguyên liệu, trộn với 900μl dung dịch chiết (giải pháp2), và trộn hoàn toàn.
----Lấy 50μl dung dịch đã chuẩn bị để xét nghiệm.
Hệ số pha loãng: 10
9. Quy trình xét nghiệm
9.1 Lưu ý trước khi xét nghiệm
9.1.1Đảm bảo tất cả thuốc thử và microwell đều ở nhiệt độ phòng (20-25℃).
9.1.2Đưa tất cả các thuốc thử còn lại về 2-8℃ngay sau khi sử dụng.
9.1.3Rửa vi giếng đúng cách là một bước quan trọng trong quy trình xét nghiệm;nó là yếu tố quan trọng đối với khả năng tái tạo của phân tích ELISA.
9.1.4 MỘTloại bỏ ánh sáng và che đậy các vi giếng trong quá trình ủ.
9.2 Các bước xét nghiệm
9.2.1 Lấy tất cả thuốc thử ra ngoài ở nhiệt độ phòng (20-25℃) trong hơn 30 phút, lắc nhẹ trước khi sử dụng.
9.2.2 Lấy các giếng vi sóng cần thiết ra ngoài và cho phần còn lại vào túi khóa zip ở 2-8℃ ngay lập tức.
9.2.3 Dung dịch rửa đã pha loãng phải được hâm nóng lại ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
9.2.4Con số:Đánh số mọi vị trí vi giếng và tất cả các tiêu chuẩn và mẫu phải được chạy trùng lặp.Ghi lại các tiêu chuẩn và vị trí mẫu.
9.2.5Add dung dịch chuẩn/mẫu và dung dịch kháng thể: Thêm 50µl dung dịch chuẩn((bộ cung cấp)) hoặc mẫu đã chuẩn bị vào các giếng tương ứng.Thêm 50µl dung dịch kháng thể (bộ cung cấp).Trộn nhẹ bằng cách lắc đĩa thủ công và ủ trong 30 phút ở 37℃ có đậy nắp.
9.2.6Rửa: Nhẹ nhàng tháo nắp và làm sạch chất lỏng ra khỏi giếng và rửa sạch các giếng siêu nhỏ bằng 250µl dung dịch rửa đã pha loãng (giải pháp3) trong khoảng thời gian 10 giây trong 4-5 lần.Thấm nước còn lại bằng giấy thấm (có thể loại bỏ bọt khí còn lại bằng đầu chưa sử dụng).
9.2.7Thêm enzyme liên hợp: Thêm 100ml dung dịch enzyme liên hợp (bộ cung cấp) vào từng giếng, trộn nhẹ và ủ trong 30 phút ở 37℃ có đậy nắp.Lặp lại bước rửa một lần nữa.
9.2.8tô màu: Thêm 50µl dung dịch A(bộ cung cấp) và 50µl dung dịch B(bộ cung cấp) cho mỗi giếng.Trộn nhẹ nhàng và ủ trong 15 phút ở 37℃ có đậy nắp.
9.2.9Đo lường: Thêm 50µl dung dịch dừng (bộ cung cấp) cho mỗi giếng.Trộn nhẹ nhàng và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450nm (Bạn nên đo ở bước sóng kép 450/630nm. Đọc kết quả trong vòng 5 phút sau khi thêm dung dịch dừng).
10. Kết quả
10.1 Phần trăm độ hấp thụ
Giá trị trung bình của các giá trị độ hấp thụ thu được đối với các tiêu chuẩn và các mẫu được chia cho giá trị độ hấp thụ của tiêu chuẩn đầu tiên (tiêu chuẩn không ) và nhân với 100%.Do đó, tiêu chuẩn không được thực hiện bằng 100% và các giá trị độ hấp thụ được trích dẫn theo tỷ lệ phần trăm.
B
Độ hấp thụ (%) = —— ×100%
B0
B ——tiêu chuẩn hấp thụ (hoặc mẫu)
B0 ——tiêu chuẩn hấp thụ bằng không
10.2 Đường cong chuẩn
---- Để vẽ đường chuẩn: Lấy giá trị độ hấp thụ của chất chuẩn làm trục y, bán logarit nồng độ của dung dịch chất chuẩn tylosin (ppb) làm trục x.
---- Nồng độ tylosin của từng mẫu (ppb), có thể đọc được từ đường chuẩn, được nhân với Hệ số pha loãng tương ứng của từng mẫu sau đó và thu được nồng độ thực tế của mẫu.
Xin hãy chú ý:
phần mềm đặc biệt đã được phát triển để phân tích dữ liệu, có thể được cung cấp theo yêu cầu.
11. Độ nhạy, độ đúng và độ chính xác
Kiểm tra độ nhạy:1,5ppb
Giới hạn phát hiện:
Mô động vật………………………….……………1.5ppb Sữa……………………………………………….....…..15ppb Sự chính xác:
Mô động vật……………………………...…………80±15%
Sữa……………..……….……80±10%
Độ chính xác:
Hệ số biến đổi của bộ ELISA nhỏ hơn 10%.
12. Thông báo
12.1 Giá trị trung bình của các giá trị độ hấp thụ thu được đối với chất chuẩn và mẫu sẽ bị giảm nếu thuốc thử và mẫu không được điều chỉnh ở nhiệt độ phòng (20-25℃).
12.2 Không để các giếng vi thể khô giữa các bước để tránh khả năng tái tạo không thành công và vận hành bước tiếp theo ngay sau khi chạm vào giá đỡ vi giếng.
12.3 Lắc nhẹ từng thuốc thử trước khi sử dụng.
12.4 Giữ da của bạn tránh xa dung dịch dừng vì nó là 0,5MH2SO4giải pháp.
12.5 Không sử dụng bộ dụng cụ đã lỗi thời.Không trao đổi thuốc thử của các lô khác nhau, nếu không sẽ làm giảm độ nhạy.
12.6 Giữ bộ dụng cụ ELISA ở 2-8℃, không bị đóng băng.Đậy kín các đĩa vi giếng còn lại, Tránh ánh nắng trực tiếp trong suốt quá trình ủ.Nên che phủ các tấm microtiter.
12.7 Dung dịch chất nền nên được loại bỏ nếu nó đổi màu.Thuốc thử có thể bị hỏng nếu giá trị độ hấp thụ (450/630nm) của chuẩn 0 nhỏ hơn 0,5 (A450nm<0,5).
12.8. Phản ứng tạo màu cần 15 phút sau khi thêm dung dịch A và dung dịch B. Và bạn có thể kéo dài thời gian ủ trong khoảng 20 phút hoặc hơn nếu màu quá nhạt không thể xác định được.Không bao giờ quá 30 phút, ngược lại, rút ngắn thời gian ủ đúng cách.
12.9 Nhiệt độ phản ứng tối ưu là 37℃.Nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn sẽ dẫn đến sự thay đổi giá trị độ nhạy và độ hấp thụ.
13. Lưu trữ
Điều kiện bảo quản: 2-8℃.
Thời gian lưu trữ: 12 tháng.
