उत्पादन

1. पृष्ठभूमि

टाइलोसिनएक म्याक्रोलाइड एन्टिबायोटिक हो, जुन मुख्यतया एन्टिब्याक्टेरियल र एन्टी-माइकोप्लाज्माको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।यस औषधिले केही समूहहरूमा गम्भीर साइड इफेक्ट निम्त्याउन सक्ने हुनाले कडा MRLs स्थापना गरिएको छ।

यो किट ELISA टेक्नोलोजीमा आधारित नयाँ उत्पादन हो, जुन सामान्य इन्स्ट्रुमेन्टल विश्लेषणको तुलनामा छिटो, सजिलो, सटीक र संवेदनशील छ र एक अपरेशनमा 1.5 घण्टा मात्र चाहिन्छ, यसले सञ्चालन त्रुटि र कामको तीव्रतालाई निकै कम गर्न सक्छ।

2. परीक्षण सिद्धान्त

यो किट अप्रत्यक्ष-प्रतिस्पर्धी ELISA प्रविधिमा आधारित छ।माइक्रोटाइटर कुवाहरू युग्मन एन्टिजनको साथ लेपित छन्।नमूनामा टायलोसिन अवशेष एन्टिबडीको लागि माइक्रोटाइटर प्लेटमा लेपित एन्टिजेनसँग प्रतिस्पर्धा गर्दछ।एन्टिबडी लेबल गरिएको इन्जाइम थपेपछि, रंग देखाउन TMB सब्सट्रेट प्रयोग गरिन्छ।नमूनाको अवशोषण नकारात्मक रूपमा यसमा रहेको टाइलोसिनसँग सम्बन्धित छ, मानक वक्रसँग तुलना गरेपछि, कमजोरी कारकद्वारा गुणा गरेपछि, नमूनामा टाइलोसिन अवशेषको मात्रा गणना गर्न सकिन्छ।

3. अनुप्रयोगहरू

यो किट जनावरको तन्तु (कुखुरा, सुँगुर, हाँस) र दूध, मह, अण्डा, आदिमा टाइलोसिन अवशेषको मात्रात्मक र गुणात्मक विश्लेषणमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।

4. क्रस-प्रतिक्रियाहरू

टाइलोसिन ……………………………………………….. १००%

तिल्मिकोसिन ……………………………………… 2%

5. आवश्यक सामग्री

5.1 उपकरणहरू:

----माइक्रोटाइटर प्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (450nm/630nm)

----रोटरी बाष्पीकरण वा नाइट्रोजन सुकाउने उपकरण

---- एकरूपता

---- शेकर

---- सेन्ट्रीफ्यूज

---- विश्लेषणात्मक सन्तुलन (प्रेरण: ०.०१ ग्राम)

----स्नातक पिपेट: 10ml

----रबर पिपेट बल्ब

---- भोल्युमेट्रिक फ्लास्क: 10ml

----Polystyrene सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब: 50ml

----माइक्रोपिपेट्स: 20-200ml, 100-1000ml

250ml-मल्टीपिपेट

5.2 अभिकर्मकहरू:

----सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH, AR)

----सोडियम बाइकार्बोनेट (NaHCO_3,AR)

---- सोडियम कार्बोनेट (NaCO₃, AR)

---- ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (एआर)

---- एसिटोनिट्रिल (एआर)

----इथाइल एसीटेट (एआर)

┅┅n-Hexane (AR)

---- विआयनीकृत पानी

6. किट अवयवहरू

l एन्टिजेन लेपित 96 वेलहरू भएको माइक्रोटाइटर प्लेट

l मानक समाधान (5 बोतल, 1 एमएल / बोतल)

0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb

l स्पिकिङ मानक नियन्त्रण: (1ml/बोतल)1ppm

l इन्जाइम कन्जुगेट 1 एमएल ……………………………………… रातो टोपी

l एन्टिबडी समाधान 7 एमएल ……………………………… हरियो टोपी

l समाधान A 7ml……………………………….. सेतो टोपी

l समाधान B 7ml ………………………………..रातो टोपी

l स्टप समाधान 7ml।……………………………… पहेंलो टोपी

l 20×केन्द्रित धुने समाधान 40ml

………………………………………………पारदर्शी टोपी

l 4×केन्द्रित निकासी समाधान 50ml

……………………………………………….. नीलो टोपी

7. अभिकर्मक तयारी:

समाधान १:0.1mol/L NaOH समाधान

0.4g NaOH देखि 100ml deionized पानीको तौल गर्नुहोस् र पूर्ण रूपमा मिलाउनुहोस्।

समाधान २: 1mol/L NaOH समाधान

4g NaOH देखि 100ml deionized पानीको तौल गर्नुहोस् र पूर्ण रूपमा मिलाउनुहोस्।

समाधान ३: कार्बोनेट बफर नुन

समाधान1: 0.2M PB

Na को 51.6 ग्राम घुल्नुहोस्₂HPO₄१२घ₂O, NaH को 8.7 ग्राम₂PO₄२ घन्₂ओ डियोनाइज्ड पानी संग र 1000ml मा पातलो।

समाधान2: निकासी समाधान

१:१(को भोल्युम अनुपातमा विआयनीकृत पानीको साथ 2xकेन्द्रित निकासी समाधानलाई पातलो गर्नुहोस्।उदाहरणका लागि 10ml 2×एक्सट्र्याक्शन समाधान + 10ml deionized पानी), जुन नमूना निकासीको लागि प्रयोग गरिनेछ,यो समाधान 1 महिनाको लागि 4 ℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ.

समाधान3: समाधान धुनुहोस्

1:19 (को भोल्युम अनुपातमा विआयनीकृत पानीको साथ 20×केन्द्रित धुने समाधानलाई पातलो गर्नुहोस्।उदाहरणका लागि 20×वाश सोल्युशनको 5ml + 95ml deionized पानी), जुन प्लेटहरू धुन प्रयोग गरिनेछ।यो समाधान 1 महिनाको लागि 4 ℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ.

8. नमूना तयारीहरू

8.1 सञ्चालन गर्नु अघि सूचना र सावधानीहरू:

(a) कृपया प्रयोगको प्रक्रियामा एक-अफ सुझावहरू प्रयोग गर्नुहोस्, र विभिन्न अभिकर्मकहरू अवशोषित गर्दा सुझावहरू परिवर्तन गर्नुहोस्।

(ख) सुनिश्चित गर्नुहोस् कि सबै उपकरणहरू सफा छन्।

(ग) टिस्यु नमूना फ्रिजमा राख्नुहोस्।

(d) तयार नमूना एकै पटक परखको लागि प्रयोग गर्नुपर्छ।

८.२ जनावरको तन्तु (कुखुरा, सुँगुर, आदि)

---- homogenizer संग नमूना एकरूप;

----एक ५० एमएल पोलिस्टायरिन सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा २.०±०.०५ ग्राम होमोजेनेट लिनुहोस्;0.2M PB को 2ml थप्नुहोस् (समाधान1) , घुल्नको लागि हल्लाउनुहोस्, र त्यसपछि 8ml एथिल एसीटेट थप्नुहोस् र 3 मिनेटको लागि कडा हल्लाउनुहोस्;

---- विभाजनको लागि अपकेंद्रित्र: 3000 ग्राम / परिवेश तापमान / 5 मिनेट।

----सुपरनेटन्ट अर्गानिक चरणको 4ml लाई 10ml गिलासको ट्यूबमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्, नाइट्रोजन ग्याँस स्ट्रिम अन्तर्गत 50-60℃ पानीको नुहाइले सुकाउनुहोस्;

---- 1ml n-hexane को साथ सुक्खा अवशेष भंग गर्नुहोस्, 30s को लागि भर्टेक्स भंग गर्नुहोस्, र त्यसपछि 1ml निकासी समाधान थप्नुहोस् (समाधान2), 1 मिनेट को लागि भंवर।विभाजनको लागि अपकेंद्रित्र: 3000g / परिवेश तापमान / 5 मिनेट

---- supernatant n-hexane चरण हटाउनुहोस्;परखको लागि सब्सट्रेट जलीय चरणको 50μl लिनुहोस्।

कमजोरी कारक: 1

८.२ दूध

---- 100μl काँचो दूधको नमूना लिनुहोस्, 900μl निकासी समाधानसँग मिलाउनुहोस् (समाधान2), र पूर्ण रूपमा मिश्रण गर्नुहोस्।

---- परखको लागि तयार समाधानको 50μl लिनुहोस्।

कमजोरी कारक: 10

9. परख प्रक्रिया

9.1 परीक्षा अघि सूचना

९.१.१सुनिश्चित गर्नुहोस् कि सबै अभिकर्मकहरू र माइक्रोवेलहरू सबै कोठाको तापक्रम (20-25 ℃) मा छन्।

९.१.२बाँकी सबै अभिकर्मकहरूलाई 2-8 मा फर्काउनुहोस्℃प्रयोग पछि तुरुन्तै।

९.१.३माइक्रोवेलहरू सही तरिकाले धुनु परखको प्रक्रियामा महत्त्वपूर्ण चरण हो;यो ELISA विश्लेषणको प्रजनन क्षमताको लागि महत्त्वपूर्ण कारक हो।

९.१.४ एप्रकाश शून्य गर्नुहोस् र इन्क्युबेशनको समयमा माइक्रोवेलहरू छोप्नुहोस्।

9.2 परख चरणहरू

9.2.1 सबै अभिकर्मकहरूलाई कोठाको तापक्रम (20-25 ℃) मा 30 मिनेट भन्दा बढीको लागि बाहिर निकाल्नुहोस्, प्रयोग गर्नु अघि हल्का हल्लाउनुहोस्।

9.2.2 आवश्यक माइक्रोवेलहरू बाहिर निकाल्नुहोस् र बाँकीलाई 2-8℃ मा तुरुन्तै जिप-लक झोलामा फर्काउनुहोस्।

9.2.3 पातलो धुने घोललाई प्रयोग गर्नु अघि कोठाको तापक्रममा पुन: वार्म गरिनुपर्छ।

९.२.४नम्बर:प्रत्येक माइक्रोवेल स्थितिहरू नम्बर गरिएको र सबै मापदण्डहरू र नमूनाहरू डुप्लिकेटमा चलाइनुपर्छ।मापदण्ड र नमूना स्थितिहरू रेकर्ड गर्नुहोस्।

९.२.५Add मानक समाधान/नमूना र एन्टिबडी समाधान: मानक समाधानको ५०µl थप्नुहोस्((किट प्रदान गरियो)) वा अनुरूप इनारहरूमा नमूना तयार।एन्टिबडी समाधान को 50µl थप्नुहोस्(किट प्रदान गरियो)।प्लेटलाई हातले हल्लाएर बिस्तारै मिलाउनुहोस् र कभरको साथ ३७ डिग्री सेल्सियसमा ३० मिनेटसम्म इन्क्युबेट गर्नुहोस्।

९.२.६धुनुहोस्: कभरलाई बिस्तारै हटाउनुहोस् र इनारबाट तरल पदार्थ शुद्ध गर्नुहोस् र माइक्रोवेललाई 250µl पातलो धुने घोलले कुल्ला गर्नुहोस् (समाधान3) 4-5 पटकको लागि 10 सेकेन्डको अन्तरालमा।अवशोषक कागजको साथ अवशिष्ट पानी अवशोषित गर्नुहोस् (बाँकी हावाको बबल प्रयोग नगरिएको टिपको साथ हटाउन सकिन्छ)।

९.२.७इन्जाइम कन्जुगेट थप्नुहोस्: इन्जाइम कन्जुगेट समाधानको 100ml थप्नुहोस्(किट प्रदान गरियो) प्रत्येक इनारमा, बिस्तारै मिलाउनुहोस् र कभरको साथ 37 डिग्री सेल्सियसमा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।पुन: धुने चरण दोहोर्याउनुहोस्.

९.२.८रंग: समाधान A( को 50µl थप्नुहोस्किट प्रदान गरियो) र 50µl समाधान B(किट प्रदान गरियोप्रत्येक इनारमा।बिस्तारै मिलाउनुहोस् र कभरको साथ 37 डिग्री सेल्सियसमा 15 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।

९.२.९मापन: स्टप समाधानको 50µl थप्नुहोस्(किट प्रदान गरियोप्रत्येक इनारमा।बिस्तारै मिलाउनुहोस् र 450nm मा अवशोषण मापन गर्नुहोस् (यो 450/630nm को दोहोरो-तरंग लम्बाइको साथ मापन गर्न सुझाव दिइएको छ। स्टप समाधान थपेपछि 5 मिनेट भित्र परिणाम पढ्नुहोस्)।

10. परिणामहरू

10.1 प्रतिशत अवशोषण

मानकहरू र नमूनाहरूका लागि प्राप्त गरिएको अवशोषण मानहरूको औसत मानहरूलाई पहिलो मानक (शून्य मानक) को अवशोषण मानले विभाजित गरी 100% ले गुणन गरिन्छ।यसरी शून्य मानकलाई १००% बराबर बनाइन्छ र अवशोषण मानहरू प्रतिशतमा उद्धृत गरिन्छ।

B

अवशोषण (%) = —— × १००%

B0

B ——अवशोषण मानक (वा नमूना)

B0 — शोषण शून्य मानक

10.2 मानक वक्र

---- एक मानक वक्र कोर्न को लागी: y-axis को रूपमा मानक को अवशोषण मान लिनुहोस्, x-axis को रूपमा tylosin मानक समाधान (ppb) को एकाग्रता को अर्ध लॉगरिदमिक।

---- प्रत्येक नमूना (ppb) को टाइलोसिन एकाग्रता, जुन क्यालिब्रेसन कर्भबाट पढ्न सकिन्छ, प्रत्येक नमूनाको सम्बन्धित डिल्युसन कारकद्वारा गुणन गरिन्छ, र नमूनाको वास्तविक एकाग्रता प्राप्त हुन्छ।

कृपया ध्यान दिनुहोस्:

डाटा विश्लेषणको लागि विशेष सफ्टवेयर विकास गरिएको छ, जुन अनुरोधमा प्रदान गर्न सकिन्छ।

11. संवेदनशीलता, शुद्धता र परिशुद्धता

परीक्षण संवेदनशीलता:1.5ppb

पत्ता लगाउने सीमा:

जनावरको तन्तु ……………………………………………… 1.5ppb दूध ………………………………………………………..१५ पीपीबी शुद्धता:

जनावरको तन्तु ………………………………………… 80±15%

दूध ……………………………………………………… 80 ± 10%

परिशुद्धता:

ELISA किट को भिन्नता गुणांक 10% भन्दा कम छ।

12. सूचना

12.1 मापदण्ड र नमूनाहरूको लागि प्राप्त गरिएको अवशोषण मानहरूको औसत मान घटाइनेछ यदि अभिकर्मक र नमूनाहरू कोठाको तापक्रम (20-25 ℃) मा विनियमित गरिएको छैन भने।

12.2 असफल प्रजननताबाट बच्न र माइक्रोवेल होल्डरमा ट्याप गरेपछि तुरुन्तै अर्को चरण सञ्चालन गर्न चरणहरू बीचमा माइक्रोवेलहरू सुक्न नदिनुहोस्।

१२.३ प्रयोग गर्नु अघि प्रत्येक अभिकर्मकलाई बिस्तारै हल्लाउनुहोस्।

12.4 तपाईंको छालालाई 0.5MH को लागि स्टप समाधानबाट टाढा राख्नुहोस्₂SO₄समाधान।

12.5 पुराना किटहरू प्रयोग नगर्नुहोस्।विभिन्न ब्याचका अभिकर्मकहरू साटासाट नगर्नुहोस्, अन्यथा यसले संवेदनशीलता छोड्नेछ।

12.6 ELISA किटहरू 2-8 ℃ मा राख्नुहोस्, फ्रिज नगर्नुहोस्।आराम माइक्रोवेल प्लेटहरू सील गर्नुहोस्, सबै इन्क्युबेशनको समयमा सीधा घामबाट बच्नुहोस्।माइक्रोटाइटर प्लेटहरू ढाक्न सिफारिस गरिन्छ।

12.7 सब्सट्रेट घोलले रङ बदल्यो भने त्यसलाई त्याग्नु पर्छ।यदि शून्य मानकको अवशोषण मान (450/630nm) 0.5 (A450nm<0.5) भन्दा कम छ भने अभिकर्मकहरू खराब हुन सक्छन्।

12.8 समाधान A र समाधान B थपेपछि रङ प्रतिक्रियालाई 15 मिनेट चाहिन्छ। र यदि रंग निर्धारण गर्न धेरै हल्का छ भने तपाईले इन्क्युबेशन समय दायरा 20 मिनेट वा सोभन्दा बढी लम्ब्याउन सक्नुहुन्छ।30 मिनेट भन्दा बढि कहिल्यै नगर्नुहोस्, यसको विपरीत, इन्क्युबेशन समय ठीकसँग छोटो पार्नुहोस्।

12.9 इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान 37 ℃ हो।उच्च वा कम तापमानले संवेदनशीलता र अवशोषण मानहरूमा परिवर्तन ल्याउनेछ।

13. भण्डारण

भण्डारण अवस्था: 2-8 ℃।

भण्डारण अवधि: 12 महिना.