Competitive Enzyme Immunoassay Kit a tilozin kvantitatív analíziséhez
Competitive Enzyme Immunoassay Kit for
Kvantitatív elemzéseTylosin
1.Háttér
Tylosinegy makrolid antibiotikum, amelyet főként antibakteriális és mikoplazma-ellenes szerként alkalmaznak.Szigorú MRL-eket állapítottak meg, mivel ez a gyógyszer bizonyos csoportokban súlyos mellékhatásokhoz vezethet.
Ez a készlet egy új ELISA technológián alapuló termék, amely a szokásos műszeres elemzésekhez képest gyors, egyszerű, pontos és érzékeny, és mindössze 1,5 órát igényel egy műveletben, jelentősen csökkenti a működési hibákat és a munka intenzitását.
2. Vizsgálati elv
Ez a készlet indirekt-kompetitív ELISA technológián alapul.A mikrotiter lyukakat kapcsoló antigénnel vonjuk be.A mintában lévő tilozin-maradék verseng a mikrotiterlemezre bevont antigénnel az antitestért.Az enzimmel jelölt anti-antitest hozzáadása után TMB szubsztrátot használunk a szín kimutatására.A minta abszorbanciája negatívan viszonyul a benne lévő tilozin maradékhoz, a standard görbével való összehasonlítás után, megszorozva a hígítási tényezővel, kiszámítható a mintában lévő tilozin maradék mennyisége.
3. Alkalmazások
Ez a készlet használható az állati szövetekben (csirke, sertés, kacsa) és tejben, mézben, tojásban stb.
4. Keresztreakciók
A tilozin…………………………………………………..100%
Tilmikozin…………………………………………………<2%
5. Szükséges anyagok
5.1 Felszerelés:
----Mikrotiterlemezes spektrofotométer (450nm/630nm)
----Rotációs elpárologtató vagy nitrogénszárító műszerek
---- homogenizáló
----Rázó
----Centrifuga
----Analitikai mérleg (induktivitás: 0,01g)
----Más pipetta: 10ml
----Gumi pipetta izzó
----Mérlőlombik: 10 ml
----Polisztirol centrifugacsövek: 50ml
----Mikropipetta: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-es multipipetta
5.2 Reagensek:
----Nátrium-hidroxid (NaOH, AR)
---- Nátrium-hidrogén-karbonát (NaHCO3,AR)
---- Nátrium-karbonát (NaCO3, AR)
----Triklór-ecetsav (AR)
---- Acetonitril (AR)
----Etil-acetát (AR)
┅┅n-hexán (AR)
----Ionmentes víz
6. A készlet összetevői
l Mikrotiter lemez 96 lyukkal, antigénnel bevonva
l Standard oldatok (5 palack, 1 ml/palack)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Szabványos tüskeszabályozás: (1 ml/üveg)1 ppm
l Enzim konjugátum 1ml…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
l Antitest oldat 7 ml……………….……zöld kupak
l A oldat 7 ml…………………….….……fehér kupak
l B oldat 7 ml………………………………..piros kupak
l Stop oldat 7 ml.………………………….sárga kupak
l 20× tömény mosóoldat 40ml
……………………………………..…átlátszó kupak
l 4× tömény extrakciós oldat 50ml
……………………………………………….kék sapka
7. Reagensek előkészítése:
1. megoldás:0,1 mol/l NaOH oldat
Mérjünk ki 0,4 g NaOH-t 100 ml ionmentesített vízhez, és keverjük össze teljesen.
2. megoldás: 1 mol/l NaOH oldat
Mérjünk ki 4 g NaOH-t 100 ml ionmentesített vízhez, és keverjük össze teljesen.
3. megoldás: Karbonát puffer só
Megoldás1: 0,2 M PB
Oldjunk fel 51,6 g Na-t2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O ionmentesített vízzel és hígítsuk fel 1000 ml-re.
Megoldás2: Extrakciós oldat
Hígítsa fel a kétszeres tömény extrakciós oldatot ionmentesített vízzel 1:1 térfogatarányban (pl. 10 ml 2x extrakciós oldat + 10 ml ionmentesített víz), amelyet mintakinyerésre fognak használni,ez az oldat 4°C-on 1 hónapig tárolható.
Megoldás3: Mosóoldat
Hígítsa fel a 20-szoros tömény mosóoldatot ionmentesített vízzel 1:19 térfogatarányban.pl. 5 ml 20x-os mosóoldat + 95 ml ionmentesített víz), amelyet a tányérok mosására használnak majd.Ez az oldat 4°C-on 1 hónapig tárolható.
8. Mintaelőkészítés
8.1 Figyelmeztetés és óvintézkedések használat előtt:
(a) Kérjük, használjon egyszeri hegyeket a kísérlet során, és változtassa meg a hegyeket, ha különböző reagenseket szív fel.
(b) Győződjön meg arról, hogy minden műszer tiszta.
c) Tartsa fagyasztva a szövetmintát.
d) Az elkészített mintát azonnal fel kell használni a vizsgálathoz.
8.2 Állati szövet (csirke, sertés stb.)
----Homogenizálja a mintát homogenizátorral;
----Vegyünk 2,0±0,05 g homogenizátumot egy 50 ml-es polisztirol centrifugacsőbe;adjunk hozzá 2 ml 0,2 M PB-t (megoldás1), rázzuk fel, hogy feloldódjon, majd adjunk hozzá 8 ml etil-acetátot, és 3 percig hevesen rázzuk;
----Centrifuga szétválasztáshoz: 3000 g / környezeti hőmérséklet / 5 perc.
----Vigyen át 4 ml felülúszó szerves fázist egy 10 ml-es üvegcsőbe, szárítsa meg 50-60 °C-os vízfürdőben nitrogéngázáram alatt;
---- Oldjuk fel a száraz maradékot 1 ml n-hexánnal, keverjük 30 másodpercig, hogy feloldódjon, majd adjunk hozzá 1 ml extrakciós oldatot (megoldás2), vortexeljük 1 percig.centrifuga szétválasztáshoz: 3000 g / környezeti hőmérséklet / 5 perc
---- Távolítsa el a felülúszó n-hexán fázist;vegyünk 50 μl szubsztrát vizes fázist a vizsgálathoz.
Hígítási tényező: 1
8.2 Tej
----Vegyünk 100 μl nyerstejmintát, keverjük össze 900 µl extrakciós oldattal (megoldás2), és alaposan keverjük össze.
----Vegyünk 50 μl-t az elkészített oldatból a vizsgálathoz.
Hígítási tényező: 10
9. A vizsgálati eljárás
9.1 Figyelmeztetés a vizsgálat előtt
9.1.1Győződjön meg arról, hogy minden reagens és mikrolyuk szobahőmérsékletű (20-25 ℃).
9.1.2Tegye vissza az összes többi reagenst a 2-8℃használat után azonnal.
9.1.3A mikrolyukak megfelelő mosása fontos lépés a vizsgálati folyamatban;ez az ELISA analízis reprodukálhatóságának létfontosságú tényezője.
9.1.4 Aürítse ki a fényt és fedje le a mikrolyukakat az inkubáció alatt.
9.2 A vizsgálat lépései
9.2.1 Vegyen ki minden reagenst szobahőmérsékleten (20-25 ℃) több mint 30 percre, használat előtt rázzuk fel óvatosan.
9.2.2 Vegye ki a szükséges mikrolyukakat, a többit pedig azonnal tegye vissza a cipzáras zacskóba 2-8°C-on.
9.2.3 A hígított mosóoldatot használat előtt szobahőmérsékletűre kell felmelegíteni.
9.2.4Szám:Számozott minden mikrolyuk pozíciót, valamint minden standardot és mintát két példányban kell futtatni.Jegyezze fel a standardokat és a minták helyzetét.
9.2.5Add standard oldat/minta és antitest oldat: Adjunk hozzá 50 µl standard oldatot ((készlet biztosított)) vagy előkészített mintát a megfelelő kutakba.Adjunk hozzá 50 µl antitest oldatot (készlet biztosított).Óvatosan keverje össze a lemez kézi rázatásával, és inkubálja 30 percig 37 °C-on lefedve.
9.2.6Mosás: Óvatosan távolítsa el a fedelet, és tisztítsa ki a folyadékot az üregekből, majd öblítse ki a mikroüregeket 250 µl hígított mosóoldattal (megoldás3) 10 másodpercenként 4-5 alkalommal.A maradék vizet nedvszívó papírral itassuk fel (a maradék levegőbuborék a fel nem használt heggyel eltávolítható).
9.2.7Adjunk hozzá enzimkonjugátumot: Adjon hozzá 100 ml enzimkonjugátum oldatot (készlet biztosított).Ismételje meg a mosási lépést.
9.2.8Színezés: Adjunk hozzá 50 µl A oldatotkészlet biztosított) és 50 µl B(készlet biztosított) minden egyes kúthoz.Óvatosan keverje össze, és lefedve inkubálja 15 percig 37 °C-on.
9.2.9Intézkedés: Adjon hozzá 50 µl leállító oldatot (készlet biztosított) minden egyes kúthoz.Óvatosan keverje össze, és mérje meg az abszorbanciát 450 nm-en (a javasolt mérés 450/630 nm kettős hullámhosszal. Olvassa le az eredményt 5 percen belül a stopoldat hozzáadása után).
10. Eredmények
10.1 Százalékos abszorbancia
A standardokra és a mintákra kapott abszorbanciaértékek átlagértékeit elosztjuk az első standard abszorbancia értékével (nulla standard ) és megszorozzuk 100%-kal.A nulla standard így egyenlő 100%-kal, és az abszorbancia értékeket százalékban adjuk meg.
B
Abszorbancia (%) = —— ×100%
B0
B — abszorbancia standard (vagy minta)
B0 — abszorbancia nulla szabvány
10.2 Standard görbe
----Egy standard görbe rajzolásához: Vegyük a standardok abszorbancia értékét az y tengelynek, a tilozin standardoldat koncentrációjának féllogaritmikus értékét (ppb) az x tengelynek.
----Az egyes minták tilozin-koncentrációját (ppb), amely a kalibrációs görbéről leolvasható, megszorozzuk az egyes követett minták megfelelő hígítási tényezőjével, és megkapjuk a minta tényleges koncentrációját.
Kérjük, vegye figyelembe:
Az adatelemzéshez speciális szoftvert fejlesztettek ki, melyet kérésre biztosítunk.
11. Érzékenység, pontosság és precizitás
Teszt érzékenység:1,5 ppb
Észlelési határ:
Állati szövet…………………………………………1,5 ppb Tej……………………………………………………..15 ppb Pontosság:
Állati szövet………………………………………80±15%
Tej…………………………………………………………80±10%
Pontosság:
Az ELISA kit variációs együtthatója kevesebb, mint 10%.
12. Figyelmeztetés
12.1 A standardokra és a mintákra kapott abszorbancia értékek átlagértékei csökkennek, ha a reagenseket és a mintákat nem szabályozták szobahőmérsékletre (20-25 ℃).
12.2 A sikertelen reprodukálhatóság elkerülése érdekében ne hagyja, hogy a mikroüregek megszáradjanak a lépések között, és a következő lépést azonnal végezze el, miután megérinti a mikroüreg-tartót.
12.3 Használat előtt finoman rázza fel az egyes reagenseket.
12.4 Tartsa távol bőrét a stop oldattól, mert 0,5MH2SO4megoldás.
12.5 Ne használja az elavult készleteket.Ne cserélje ki a különböző tételek reagenseit, különben csökken az érzékenység.
12.6 Tartsa az ELISA készleteket 2-8°C-on, ne fagyassza le.Zárja le a maradék mikrolyuk lemezeket. Kerülje az egyenes napfényt minden inkubáció alatt.A mikrotiterlemezek lefedése javasolt.
12.7 Az aljzatoldatot el kell hagyni, ha elszíneződik.A reagensek megromolhatnak, ha a nulla standard abszorbancia értéke (450/630 nm) kisebb, mint 0,5 (A450 nm<0,5).
12.8 A színezési reakcióhoz 15 percre van szükség az A és a B oldat hozzáadása után. Az inkubációs idő 20 percre vagy még hosszabbra is meghosszabbítható, ha a szín túl világos ahhoz, hogy meghatározható legyen.Soha ne haladja meg a 30 percet, éppen ellenkezőleg, megfelelően rövidítse le az inkubációs időt.
12.9 Az optimális reakcióhőmérséklet 37 ℃.A magasabb vagy alacsonyabb hőmérséklet az érzékenység és az abszorbancia értékek változásához vezet.
13. Tárolás
Tárolási állapot: 2-8℃.
Tárolási idő: 12 hónap.
