Competitive Enzyme Immunoassay Kit alang sa Quantitative Analysis sa Tylosin
Competitive Enzyme Immunoassay Kit alang sa
Quantitative Analysis saTylosin
1. Background
Tylosinmao ang usa ka macrolide antibiotic, nga nag-una nga gigamit ingon nga antibacterial ug anti-mycoplasma.Ang mga estrikto nga MRL natukod tungod kay kini nga tambal mahimong mosangpot sa seryoso nga epekto sa pipila ka mga grupo.
Ang kini nga kit usa ka bag-ong produkto nga gibase sa teknolohiya sa ELISA, nga paspas, dali, tukma ug sensitibo kung itandi sa sagad nga pagtuki sa instrumento ug kinahanglan ra ang 1.5 ka oras sa usa ka operasyon, mahimo’g maminusan ang sayup sa operasyon ug kusog sa pagtrabaho.
2. Prinsipyo sa Pagsulay
Kini nga kit gibase sa dili direkta nga kompetisyon nga teknolohiya sa ELISA.Ang mga atabay sa microtiter gitabonan sa coupling antigen.Ang nahabilin nga tylosin sa sample nakigkompetensya sa antigen nga adunay sapaw sa microtiter plate alang sa antibody.Pagkahuman sa pagdugang sa enzyme nga gimarkahan nga anti-antibody, ang substrate sa TMB gigamit aron ipakita ang kolor.Ang pagsuyup sa sample negatibo nga may kalabutan sa tylosin nga nagpuyo niini, pagkahuman sa pagtandi sa Standard Curve, nga gipadaghan sa dilution factor, ang tylosin residue nga gidaghanon sa sample mahimong makalkula.
3. Mga aplikasyon
Kini nga kit mahimong gamiton sa quantitative ug qualitative analysis sa tylosin residue sa animal tissue (manok, baboy, itik) ug gatas, dugos, itlog, ug uban pa.
4. Mga cross-reaksyon
Tylosin……………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………<2%
5. Mga Materyal nga Gikinahanglan
5.1 Kagamitan:
----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)
---- Rotary evaporator o nitrogen drying instruments
----homogenizer
----Tagalog
----Centrifuge
---- Analytical balanse (inductance: 0.01g)
----Migraduwar nga pipette: 10ml
----Goma nga pipette nga bombilya
----Volumetric flask: 10ml
----Polystyrene centrifuge tubo: 50ml
----Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Reagents:
----Sodium hydroxide (NaOH, AR)
----Sodium bicarbonate (NaHCO3,AR)
---- Sodium carbonate (NaCO3, AR)
----Trichloroacetic acid (AR)
---- Acetonitrile (AR)
----Ethyl acetate (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----Deionized nga tubig
6. Mga sangkap sa Kit
l Microtiter plate nga adunay 96 ka atabay nga adunay sapaw sa antigen
l Mga standard nga solusyon (5 ka botelya, 1ml/botelya)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking standard control: (1ml/botelya)1ppm
l Enzyme conjugate 1ml………………………..pula nga takup
l Antibody nga solusyon 7ml………………………..berde nga takup
l Solusyon A 7ml………………………………..puti nga takup
l Solusyon B 7ml...………………………………………….pula nga takup
l Ihunong ang solusyon 7ml.…………………………………….yellow cap
l 20×concentrated wash solution 40ml
…………………………………..…transparent nga takup
l 4 × konsentrado nga solusyon sa pagkuha 50ml
…………………………………………….asul nga kalo
7. Pagpangandam sa Reagents:
Solusyon 1:0.1mol/L nga solusyon sa NaOH
Timbanga ang 0.4g NaOH ngadto sa 100ml nga deionized nga tubig ug isagol sa hingpit.
Solusyon 2: 1mol/L nga solusyon sa NaOH
Timbanga ang 4g NaOH ngadto sa 100ml nga deionized nga tubig ug isagol sa hingpit.
Solusyon 3: Carbonate buffer nga asin
Solusyon1: 0.2M PB
Dissolve 51.6g sa Na2HPO4· 12H2O, 8.7g sa NaH2PO4· 2H2O uban sa deionized nga tubig ug dilute ngadto sa 1000ml.
Solusyon2: Solusyon sa pagkuha
Dilute ang 2×concentrated extraction solution sa deionized nga tubig sa volume ratio nga 1:1(eg 10ml sa 2×extraction solution + 10ml sa deionized nga tubig), nga gamiton para sa sample extraction,kini nga solusyon mahimong tipigan sa 4 ℃ sulod sa 1 ka bulan.
Solusyon3: Hugasan nga solusyon
Dilute ang 20 × concentrated nga solusyon sa paghugas sa deionized nga tubig sa volume ratio nga 1:19(eg 5ml sa 20×wash solution + 95ml sa deionized nga tubig), nga gamiton sa paghugas sa mga plato.Kini nga solusyon mahimong tipigan sa 4 ℃ sulod sa 1 ka bulan.
8. Sampol nga Pagpangandam
8.1 Pahibalo ug pag-amping sa wala pa ang operasyon:
(a) Palihog gamita ang one-off nga mga tip sa proseso sa eksperimento, ug usba ang mga tip kung mosuhop sa lain-laing reagent.
(b) Siguroha nga limpyo ang tanang instrumento.
(c) Itago ang sample sa tisyu sa freeze.
(d) Ang giandam nga sampol kinahanglang gamiton dayon alang sa pagsulay.
8.2 Mga tisyu sa mananap (manok, baboy, ug uban pa)
----I-homogenize ang sample gamit ang homogenizer;
---- Dad-a ang 2.0±0.05g sa homogenate ngadto sa 50ml polystyrene centrifuge tube;idugang ang 2ml sa 0.2M PB (solusyon1) , pag-uyog aron matunaw, ug dayon idugang ang 8ml nga ethyl acetate ug kusog nga pag-uyog sa 3min;
---- Centrifuge alang sa pagbulag: 3000g / ambient temperatura / 5min.
---- Ibalhin ang 4ml sa supernatant organic phase ngadto sa 10ml glass tube, uga sa 50-60 ℃ water bath ubos sa nitrogen gas stream;
---- Dissolve ang uga nga salin sa 1ml sa n-hexane, vortex alang sa 30s aron matunaw, ug dayon idugang ang 1ml nga solusyon sa pagkuha (solusyon2), vortex sa 1 min.centrifuge alang sa pagbulag: 3000g / ambient temperature / 5min
----Kuhaa ang supernatant n-hexane phase;kuhaa ang 50μl sa substrate aqueous phase para sa assay.
Dilution factor: 1
8.2 Gatas
----Pagkuha og 100μl nga hilaw nga sampol sa gatas, isagol sa 900μl nga solusyon sa pagkuha (solusyon2), ug isagol sa hingpit.
----Pagkuha og 50μl sa giandam nga solusyon para sa assay.
Dilution hinungdan: 10
9. Proseso sa pagsulay
9.1 Matikdi sa dili pa ang pagsulay
9.1.1Siguruha nga ang tanan nga mga reagents ug microwell anaa sa temperatura sa kwarto (20-25 ℃).
9.1.2Ibalik ang tanan nga nahabilin nga mga reagents sa 2-8℃diha-diha dayon human sa paggamit.
9.1.3Ang paghugas sa mga microwell sa husto usa ka importante nga lakang sa proseso sa pagsulay;kini mao ang importante nga butang sa reproducibility sa ELISA analysis.
9.1.4 Akuhaa ang kahayag ug tabuni ang mga microwell sa panahon sa paglumlum.
9.2 Mga Lakang sa Pagsusi
9.2.1 Ipagawas ang tanang reagents sa temperatura sa lawak (20-25 ℃) sulod sa sobra sa 30min, hinayhinay nga uyog sa dili pa gamiton.
9.2.2 Kuhaa ang mga microwell nga gikinahanglan ug ibalik ang nahabilin sa zip-lock bag sa 2-8 ℃ dayon.
9.2.3 Ang lasaw nga solusyon sa paghugas kinahanglang ipainit pag-usab nga anaa sa temperatura sa lawak sa dili pa gamiton.
9.2.4Numero:Ginumero ang matag posisyon sa microwell ug ang tanan nga mga sumbanan ug mga sample kinahanglan nga ipadagan sa doble.Irekord ang mga sumbanan ug mga sampol nga posisyon.
9.2.5Add standard nga solusyon/sampol ug solusyon sa antibody: Idugang ang 50µl sa standard nga solusyon((kit nga gihatag)) o giandam nga sample sa katugbang nga mga atabay.Idugang ang 50µl nga solusyon sa antibody(kit nga gihatag).Hinay-hinay nga pag-mix pinaagi sa pag-uyog sa plato nga mano-mano ug paglumlom sa 30min sa 37 ℃ nga adunay tabon.
9.2.6Hugasan: Hinayhinay kuhaa ang tabon ug putli ang likido gikan sa mga atabay ug hugasan ang mga microwell gamit ang 250µl diluted wash solution (solusyon3) sa agwat sa 10s alang sa 4-5 ka beses.Absorb ang nahabilin nga tubig gamit ang absorbent nga papel (ang nahabilin nga bula sa hangin mahimong mawagtang gamit ang wala magamit nga tip).
9.2.7Idugang ang enzyme conjugate: Pagdugang og 100ml nga enzyme conjugate solution(kit nga gihatag) sa matag atabay, hinayhinay isagol ug ilumlom sulod sa 30min sa 37 ℃ nga adunay taklob.Balika pag-usab ang lakang sa paghugas.
9.2.8Pagkolor: Idugang ang 50µl nga solusyon A(kit nga gihatag) ug 50µl nga solusyon B(kit nga gihatag) sa matag atabay.Hinay-hinay nga pagsagol ug paglumlom sa 15min sa 37 ℃ nga adunay tabon.
9.2.9Sukda: Idugang ang 50µl sa stop solution(kit nga gihatag) sa matag atabay.Hinay-hinay nga pagsagol ug sukda ang pagsuyop sa 450nm (Gisugyot nga sukod nga adunay dual-wavelength nga 450/630nm. Basaha ang resulta sulod sa 5min pagkahuman sa pagdugang sa stop solution).
10. Resulta
10.1 Porsiyento nga pagsuyop
Ang kahulogan nga mga bili sa mga bili sa pagsuyop nga nakuha alang sa mga sumbanan ug sa mga sampol gibahin sa kantidad sa pagsuyop sa unang sumbanan (zero standard ) ug gipadaghan sa 100%.Ang zero standard gihimo nga katumbas sa 100% ug ang absorbance values gikutlo sa porsyento.
B
Pagsuyop (%) = —— ×100%
B0
B ——standard sa pagsuyup (o sample)
B0 ——absorbance zero standard
10.2 Standard Curve
----Aron magdrowing og standard curve: Kuhaa ang absorbance value sa mga standard isip y-axis, semi logarithmic sa konsentrasyon sa tylosin standards solution (ppb) isip x-axis.
----Ang tylosin concentration sa matag sample (ppb), nga mabasa gikan sa calibration curve, gipadaghan sa katugbang nga Dilution factor sa matag sample nga gisundan, ug ang aktuwal nga konsentrasyon sa sample makuha.
Palihug timan-i:
espesyal nga software ang naugmad alang sa data analysis, nga mahimong ihatag sa hangyo.
11. Pagkasensitibo, katukma ug katukma
Pagkasensitibo sa Pagsulay:1.5ppb
Limitado sa pagkakita:
tissue sa mananap……………………………………………………1.5ppb Gatas………………………………………………………..15ppb Katukma:
Tisyu sa mananap………………………………………… 80±15%
Gatas…………………………………………………… 80±10%
Katukma:
Ang variation coefficient sa ELISA kit kay ubos pa sa 10%.
12. Matikdi
12.1 Ang mean values sa absorbance values nga nakuha para sa standards ug samples mapakunhod kung ang reagents ug samples wala pa ma-regulate sa room temperature (20-25 ℃).
12.2 Ayaw tugoti ang microwell nga mamala sa taliwala sa mga lakang aron malikayan ang dili malampuson nga pag-reproducibility ug operate ang sunod nga lakang pagkahuman dayon sa pag-tap sa microwells holder.
12.3 Hinayhinay nga pag-uyog ang matag reagent sa dili pa gamiton.
12.4 Ipahilayo ang imong panit gikan sa stop solution kay kini 0.5MH2SO4solusyon.
12.5 Ayaw gamita ang mga kit nga wala na sa petsa.Ayaw ibaylo ang mga reagents sa lain-laing mga batch, o kung dili kini makahulog sa pagkasensitibo.
12.6 Ipadayon ang ELISA kits sa 2-8 ℃, ayaw pag-freeze.Seal rest microwell plates, Likayi ang tul-id nga kahayag sa adlaw sa tanang paglumlum.Girekomenda ang pagtabon sa mga plato sa microtiter.
12.7 Ang substrate nga solusyon kinahanglan nga biyaan kung kini mahimong kolor.Ang mga reagents mahimong mahimong dili maayo kung ang absorbance value (450/630nm) sa zero standard mas ubos kay sa 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 Ang reaksyon sa pagkolor nanginahanglan 15min pagkahuman sa pagdugang sa solusyon A ug solusyon B. Ug mahimo nimong lugwayan ang oras sa paglumlum sa 20min o labaw pa kung ang kolor labi ka gaan aron matino.Ayaw molapas sa 30min, sa sukwahi, pagpamubo sa oras sa paglumlum sa husto.
12.9 Ang labing maayo nga temperatura sa reaksyon mao ang 37 ℃.Ang mas taas o mas ubos nga temperatura mosangpot sa mga kausaban sa pagkasensitibo ug pagsuyop nga mga bili.
13. Pagtipig
Kahimtang sa pagtipig: 2-8 ℃.
Panahon sa pagtipig: 12 ka bulan.
