Маҷмӯаи рақобатпазири иммуноассай барои таҳлили миқдории тилозин
Маҷмӯаи рақобатпазири иммуноассай барои
Таҳлили миқдорӣТилозин
1. Замина
Тилозинантибиотики макролид мебошад, ки асосан ҳамчун антибактериалӣ ва зидди микоплазма истифода мешавад.MRL-ҳои қатъӣ муқаррар карда шудаанд, зеро ин дору метавонад дар гурӯҳҳои алоҳида ба таъсири ҷиддии тараф оварда расонад.
Ин маҷмӯа маҳсулоти навест, ки дар асоси технологияи ELISA асос ёфтааст, ки дар муқоиса бо таҳлили маъмулии инструменталӣ зуд, осон, дақиқ ва ҳассос аст ва дар як амалиёт танҳо 1,5 соат лозим аст, он метавонад хатогии амалиёт ва шиддатнокии корро ба таври қобили мулоҳиза кам кунад.
2. Принсипи санҷиш
Ин маҷмӯа ба технологияи бавосита-рақобати ELISA асос ёфтааст.Чоҳҳои микротитрҳо бо антигени пайвасткунанда пӯшонида шудаанд.Боқимондаи тилозин дар намуна бо антигене, ки дар лавҳаи микротитр барои антитело фаро гирифта шудааст, рақобат мекунад.Пас аз илова кардани фермент бо нишони зидди антитело, субстрати TMB барои нишон додани ранг истифода мешавад.Азхудкунии намуна бо резиденти тилозин дар он манфӣ дорад, пас аз муқоиса бо каҷи стандартӣ, ки бо омили ҳалшаванда зарб карда мешавад, миқдори боқимондаи тилозинро дар намуна ҳисоб кардан мумкин аст.
3. Барномаҳо
Ин маҷмӯаро метавон дар таҳлили миқдорӣ ва сифатии боқимондаи тилозин дар бофтаи ҳайвонот (мурғ, хук, мурғ) ва шир, асал, тухм ва ғайра истифода бурд.
4. Реаксияҳои байниҳамдигарӣ
Тилозин………………………………………………..100%
Тилмикозин……………………………………………<2%
5. Маводҳои зарурӣ
5.1 Таҷҳизот:
---- Спектрофотометри пластинкаи микротитр (450нм/630нм)
----Асбобҳои бухоркунандаи гардишкунанда ё азот хушккунанда
----гомогенизатор
----Шакер
---- Центрифуга
---- Тавозуни таҳлилӣ (индуктивӣ: 0,01 г)
---- Пипеткаи хатмкарда: 10 мл
---- Лампочкаи пипеткаи резинӣ
---- Колбаи ҳаҷмӣ: 10 мл
----Турбаҳои полистиролӣ: 50мл
----Микропипетҳо: 20-200мл, 100-1000мл
250 мл-мултипипета
5.2 Реактивҳо:
----гидроксиди натрий (NaOH, AR)
----Бикарбонати натрий (NaHCO3,AR)
---- Карбонати натрий (NaCO3, AR)
---- Кислотаи трихлорассусӣ (AR)
---- Ацетонитрил (AR)
---- этилацетат (AR)
┅┅н-гексан (AR)
---- Оби деионизатсияшуда
6. Унсурҳои маҷмӯа
л Пластинкаи микротитрӣ бо 96 чоҳ, ки бо антиген фаро гирифта шудааст
л Маҳлулҳои стандартӣ (5 шиша, 1 мл / шиша)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Назорати стандартӣ: (1 мл / шиша)1 саҳ
л Конъюгат фермент 1мл…………………………………………………
л Маҳлули антитело 7мл……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
l Маҳлули А 7мл…………………….….…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
l Маҳлули В 7мл……………………………..сарпӯши сурх
l Маҳлули қатъ 7мл.……………….……….сарпӯши зард
л 20 × маҳлули шустани консентратӣ 40 мл
.................................................................... ... Cap шаффоф
л 4 × маҳлули консентратсияи истихроҷ 50ml
………………………………………………….кабуд
7. Тайёр кардани реактивҳо:
Ҳалли 1:Маҳлули 0,1моль/л NaOH
0,4 г NaOH-ро то 100 мл оби деионизатсияшуда баркашида, пурра омехта кунед.
Ҳалли 2: 1моль/л маҳлули NaOH
4 г NaOH-ро то 100 мл оби деионизатсияшуда баркашида, пурра омехта кунед.
Ҳалли 3: Намаки буферии карбонатӣ
Ҳалли1: 0,2 МБ
51,6 г Na-ро махлул кунед2HPO4· 12С2О, 8,7 г NaH2PO4· 2H2О бо оби деионизатсияшуда ва то 1000 мл маҳлул кунед.
Ҳалли2: Маҳлули истихроҷ
Маҳлули 2× консентратсияи экстраксияро бо оби деионизатсияшуда дар таносуби ҳаҷми 1:1 (масалан, 10 мл маҳлули 2 × экстраксия + 10 мл оби деионизатсияшуда), ки барои истихроҷи намуна истифода мешавад,Ин маҳлулро дар ҳарорати 4℃ барои 1 моҳ нигоҳ доштан мумкин аст.
Ҳалли3: Маҳлули шустан
Маҳлули шустани 20 × консентратсиониро бо оби деионизатсияшуда дар таносуби ҳаҷми 1:19 (масалан, 5 мл маҳлули 20 × шустан + 95 мл оби деионизатсияшуда), ки барои шустани плитахо истифода мешавад.Ин маҳлулро дар ҳарорати 4℃ барои 1 моҳ нигоҳ доштан мумкин аст.
8. Омодасозии намуна
8.1 Огоҳӣ ва чораҳои эҳтиётӣ пеш аз истифода:
(a) Лутфан, дар раванди озмоиш маслиҳатҳои якдафъаинаро истифода баред ва ҳангоми азхудкунии реагентҳои гуногун маслиҳатҳоро иваз кунед.
(б) Боварӣ ҳосил кунед, ки ҳама асбобҳо тоза мебошанд.
(в) Намунаи бофтаро дар яхдон нигоҳ доред.
(г) Намунаи омодашуда бояд якбора барои таҳлил истифода шавад.
8.2 Бофтаи ҳайвонот (мурғ, гӯшти хук ва ғ.)
---- Намунаро бо гомогенизатор яксон кунед;
----2,0±0,05г гомогенатро ба найчаи сентрифугаи полистироли 50 мл гиред;илова 2мл 0,2M PB (ҳалли1) , чунбонда, то ҳал шавад, ва сипас 8 мл этилацетати илова кунед ва 3 дақиқа сахт ҷунбонед;
---- Центрифуга барои ҷудокунӣ: 3000г / ҳарорати муҳити зист / 5дақ.
---- 4 мл фазаи органикии супернатантро ба найчаи шишагии 10 мл гузаронед, бо ваннаи обии 50-60 ℃ зери ҷараёни гази нитроген хушк кунед;
---- Боқимондаи хушкро бо 1 мл н-гексан маҳлул кунед, гирдоби 30 сония барои ҳал кардан ва сипас 1 мл маҳлули экстраксияро илова кунед (ҳалли2), гирдоб барои 1 дақиқа.центрифуга барои ҷудокунӣ: 3000г / ҳарорати муҳити зист / 5дақ
----Фазаи болоии н-гексанро хориҷ кунед;50 мкл фазаи обии субстратро барои ташхис гиред.
Омили ҳалкунанда: 1
8.2 Шир
---- 100 мкл намунаи шири хом гиред, бо 900 мкл маҳлули экстракционӣ омехта кунед (ҳалли2) ва комилан омехта кунед.
---- 50 мкл маҳлули омодашударо барои таҳлил гиред.
Омили ҳалшаванда: 10
9. Раванди таҳлил
9.1 Огоҳӣ пеш аз ташхис
9.1.1Боварӣ ҳосил кунед, ки ҳама реактивҳо ва қулфҳо дар ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) ҳастанд.
9.1.2Ҳама реактивҳои боқимондаро ба 2-8 баргардонед℃фавран пас аз истифода.
9.1.3Дуруст шустани қубурҳои микроэлементҳо қадами муҳим дар раванди таҳлил аст;он омили муҳими такроршавандагии таҳлили ELISA мебошад.
9.1.4 Анурро холӣ кунед ва дар вақти инкубатсия кӯлҳои хурдро пӯшонед.
9.2 Қадамҳои санҷиш
9.2.1 Ҳама реактивҳоро дар ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) барои зиёда аз 30 дақиқа гиред, пеш аз истифода мулоим такон диҳед.
9.2.2 Хуруҷҳои лозимиро берун кунед ва боқимондаро дар ҳарорати 2-8 ℃ фавран ба халтаи қуфл баргардонед.
9.2.3 Маҳлули шустани маҳлулшуда бояд пеш аз истифода гарм карда шавад, то дар ҳарорати хонагӣ бошад.
9.2.4Рақам:Рақамгузорӣ кардани ҳар як мавқеъи микроэлементҳо ва ҳама стандартҳо ва намунаҳо бояд дар ду нусха иҷро карда шаванд.Мавқеъҳои стандартҳо ва намунаҳоро сабт кунед.
9.2.5Add маҳлули стандартӣ/намуна ва маҳлули антитело: Иловаи 50мл маҳлули стандартӣ((маҷмӯа дода шудааст)) ё намунаи ба чоҳҳои мувофиқ омодашуда.Иловаи 50мл маҳлули антитело (маҷмӯа дода шудааст).Табақро ба таври дастӣ ҷунбонда, мулоим омехта кунед ва дар давоми 30 дақиқа дар 37 ° C бо сарпӯш инкубатсия кунед.
9.2.6Шустан: Сарпӯшро бодиққат бардоред ва моеъро аз чоҳҳо тоза кунед ва микрочокҳоро бо маҳлули шустани 250 мкл (ҳалли3) дар фосилаи 10 сония 4-5 маротиба.Оби боқимондаро бо коғази абсорбент ҷаббида кунед (ҳубобчаи ҳавои боқимондаро бо нӯги истифоданашуда нест кардан мумкин аст).
9.2.7Илова кардани конъюгат фермент: Иловаи 100 мл маҳлули конъюгатии фермент (маҷмӯа дода шудааст) ба ҳар як чоҳ, мулоим омехта кунед ва барои 30 дақиқа дар 37 ℃ бо сарпӯш инкуб кунед.Қадами шустанро боз такрор кунед.
9.2.8Рангкунӣ: Иловаи 50мл маҳлули A(маҷмӯа дода шудааст) ва 50мл маҳлули B(маҷмӯа дода шудааст) ба хар як чох.Бодиққат омехта кунед ва 15 дақиқа дар ҳарорати 37 ° C бо сарпӯши инкубатсия кунед.
9.2.9Чен кардан: 50мл маҳлули қатъро илова кунед (маҷмӯа дода шудааст) ба хар як чох.Бо нарм омехта кунед ва абсорбенсро дар 450 нм чен кунед (Ин ченак бо дарозии дугонаи мавҷи 450/630 нм тавсия дода мешавад. Натиҷаро дар давоми 5 дақиқа пас аз илова кардани маҳлули қатъӣ хонед).
10. Натиҷаҳо
10.1 Фоизи ҷаббида
Қиматҳои миёнаи ҷаббида барои стандартҳо ва намунаҳо ба арзиши абсорбсияи стандарти якум (стандарти сифр) тақсим карда, ба 100% зарб карда мешаванд.Ҳамин тариқ, стандарти сифр ба 100% баробар карда мешавад ва арзишҳои ҷаббида бо фоизҳо оварда шудаанд.
B
Абсорбсия (%) = —— ×100%
B0
B ——стандарти азхудкунӣ (ё намуна)
В0 ——стандарти сифри азхудкунй
10.2 Каҷи стандартӣ
----Барои кашидани каҷи стандартӣ: Қимати ҷаббиши стандартҳоро ҳамчун меҳвари Y, нимлогарифмикии консентратсияи маҳлули стандартҳои тилозин (ppb) ҳамчун меҳвари x гиред.
---- Консентратсияи тилозини ҳар як намуна (ppb), ки онро аз каҷи калибрченкунӣ хондан мумкин аст, ба омили мувофиқи маҳлули ҳар як намунаи пайравӣ зарб карда мешавад ва консентратсияи воқеии намуна ба даст оварда мешавад.
Лутфан таваҷҷӯҳ намоед:
барои тахлили маълумот программам махсус тартиб дода шудааст, ки онро мувофики талаб пешниход кардан мумкин аст.
11. Ҳассосият, дақиқ ва дақиқ
Ҳассосияти санҷиш:1,5 саҳ
Маҳдудияти ошкор:
Бофтаи ҳайвонот…………………………………………1,5ppb Шир…………………………………………………..15ppb Дақиқӣ:
Бофтаи ҳайвонот………………………………………80±15%
Шир……………………………………………………………80±10%
Дақиқӣ:
Коэффисиенти тағирёбии маҷмӯаи ELISA камтар аз 10% аст.
12. Огоҳӣ
12.1 Агар реагентҳо ва намунаҳо то ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) танзим нашуда бошанд, қиматҳои миёнаи қимматҳои ҷаббида барои стандартҳо ва намунаҳо кам карда мешаванд.
12.2 Нагузоред, ки қуттиҳои хурд дар байни қадамҳо хушк шаванд, то аз такрори бомуваффақият канорагирӣ кунед ва қадами ояндаро фавран пас аз ламс кардани дорандаи микрочойкҳо иҷро кунед.
12.3 Пеш аз истифода ҳар як реагентро бодиққат ҷунбонед.
12.4 Пӯсти худро аз маҳлули қатъӣ дур нигоҳ доред, зеро он 0,5 МГ аст2SO4ҳалли.
12.5 Маҷмӯаҳои кӯҳнаро истифода набаред.Реагентҳои партияҳои гуногунро иваз накунед, вагарна он ҳассосиятро паст мекунад.
12.6 Маҷмӯаҳои ELISA -ро дар ҳарорати 2-8 ℃ нигоҳ доред, ях накунед.Лавҳаҳои хурдро мӯҳр кунед, Дар давоми ҳама инкубатсияҳо аз нурҳои рости офтоб худдорӣ намоед.Пӯшидани лавҳаҳои микротитр тавсия дода мешавад.
12.7 Маҳлули субстрат, агар он рангҳоро гирад, бояд тарк карда шавад.Агар арзиши абсорбсия (450/630нм) аз стандарти сифр камтар аз 0,5 (A450nm<0,5) бошад, реагентҳо метавонанд бад шаванд.
12.8 Реаксияи рангоранг пас аз илова кардани маҳлули А ва маҳлули B 15 дақиқа лозим аст. Ва шумо метавонед давраи инкубатсияро то 20 дақиқа ё бештар аз он дароз кунед, агар ранг барои муайян кардан хеле сабук бошад.Ҳеҷ гоҳ аз 30 дақиқа зиёд нашавед, баръакс вақти инкубатсияро дуруст кӯтоҳ кунед.
12.9 Ҳарорати оптималии реаксия 37℃ аст.Ҳарорати баланд ё паст боиси тағирёбии арзишҳои ҳассосият ва ҷаббида мегардад.
13. Нигоҳдорӣ
Ҳолати нигоҳдорӣ: 2-8 ℃.
Муҳлати нигоҳдорӣ: 12 моҳ.
