Набор для канкурэнтнага імунаферментнага аналізу для колькаснага аналізу тылазіну
Набор для канкурэнтнага імунаферментнага аналізу
Колькасны аналізТылазін
1. Перадгісторыя
Тылазінз'яўляецца макролидным антыбіётыкам, які ў асноўным выкарыстоўваецца ў якасці антыбактэрыйнага і супраць мікоплазмы.Устаноўлены строгія МДУ, паколькі гэты прэпарат можа выклікаць сур'ёзныя пабочныя эфекты ў пэўных груп.
Гэты набор з'яўляецца новым прадуктам, заснаваным на тэхналогіі ELISA, якая з'яўляецца хуткай, лёгкай, дакладнай і адчувальнай у параўнанні са звычайным інструментальным аналізам і займае ўсяго 1,5 гадзіны на адну аперацыю, што можа значна мінімізаваць памылку аперацыі і інтэнсіўнасць працы.
2. Прынцып тэсту
Гэты набор заснаваны на тэхналогіі непрамога канкурэнтнага ІФА.Лункі мікратытратара пакрытыя спалучальным антыгенам.Рэшткі тылазіну ва ўзоры канкуруюць з антыгенам, пакрытым на мікратытрацыйнай пласціне, за антыцелы.Пасля дадання пазначаных ферментам анты-антыцелаў для адлюстравання колеру выкарыстоўваецца субстрат TMB.Абсорбцыя ўзору адмоўна залежыць ад утрымання ў ім тылазіну. Пасля параўнання са стандартнай крывой, памножанай на каэфіцыент развядзення, можна вылічыць колькасць рэшткаў тылазіну ў пробе.
3. Дадаткі
Гэты набор можна выкарыстоўваць для колькаснага і якаснага аналізу рэшткаў тылазіну ў тканінах жывёл (курыца, свініна, качка), а таксама ў малацэ, мёдзе, яйках і г.д.
4. Крыжаваныя рэакцыі
Тылазін………………………………………………..100%
Цілміказін………………………………………………<2%
5. Неабходныя матэрыялы
5.1 Абсталяванне:
----Спектрафатометр мікратытрацыйнай пласціны (450 нм/630 нм)
---- Ротарны выпарнік або прыборы для сушкі азотам
---- гамагенізатар
----Шэйкер
---- Цэнтрыфуга
----Аналітычныя вагі (індуктыўнасць: 0,01 г)
---- Градуяваная піпетка: 10 мл
----Гумавая піпетка
---- Мерная колба: 10 мл
---- Полістыролавыя цэнтрыфужныя прабіркі: 50 мл
---- Мікрапіпеткі: 20-200 мл, 100-1000 мл
250 мл - мультипипетка
5.2 Рэагенты:
----Гідраксід натрыю (NaOH, AR)
---- Бікарбанат натрыю (NaHCO3,AR)
---- Карбанат натрыю (NaCO3, AR)
----Трихлоруксусная кіслата (AR)
---- Ацэтанітрыл (AR)
----Этылацэтат (AR)
┅┅н-Гексан (AR)
---- Дэіянізаваная вада
6. Камплекты камплекта
l Планшэт для мікратытрацыі з 96 лункамі, пакрытых антыгенам
l Стандартныя растворы (5 бутэлек, 1 мл/бутэлька)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Стандартны кантроль узмацнення: (1 мл/бутэлька)1 праміле
l Ферментны кан'югат 1 мл……………..…..…чырвоны каўпачок
l Раствор антыцелаў 7 мл……………….……зялёны каўпачок
l Раствор A 7 мл…………………….………белы каўпачок
l Раствор B 7 мл...……………………………..чырвоны каўпачок
l Стоп-раствор 7 мл.……………….……….жоўты каўпачок
л 20 × канцэнтраваны раствор для мыцця 40 мл
…………………………………..…празрысты каўпак
л 4 × канцэнтраваны экстракцыйны раствор 50 мл
……………………………………………….сіняя шапка
7. Падрыхтоўка рэагентаў:
Рашэнне 1:Раствор NaOH 0,1 моль/л
Узважце 0,4 г NaOH да 100 мл дэіянізаванай вады і цалкам змяшайце.
Рашэнне 2: 1моль/л раствора NaOH
Узважце 4 г NaOH да 100 мл дэіянізаванай вады і цалкам змяшайце.
Рашэнне 3каментар : Карбанатная буферная соль
Рашэнне1: 0,2 МПБ
Растварыць 51,6 г Na2HPO4· 12 гадзін2O, 8,7 г NaH2PO4·2H2O дэіянізаванай вадой і развядзіце да 1000 мл.
Рашэнне2: Раствор экстракцыі
Развядзіце 2× канцэнтраваны экстракцыйны раствор дэіянізаванай вадой у аб'ёмных суадносінах 1:1(напрыклад, 10 мл 2 × раствора для экстракцыі + 10 мл дэіянізаванай вады), які будзе выкарыстоўвацца для здабывання проб,гэты раствор можна захоўваць пры 4℃ на працягу 1 месяца.
Рашэнне3: Раствор для прамывання
Развядзіце 20× канцэнтраваны раствор для прамывання дэіянізаванай вадой у аб'ёмных суадносінах 1:19(напрыклад, 5 мл раствора для мыцця 20 × + 95 мл дэіянізаванай вады), які будзе выкарыстоўвацца для мыцця талерак.Гэты раствор можна захоўваць пры тэмпературы 4 ℃ на працягу 1 месяца.
8. Падрыхтоўка проб
8.1 Заўвага і меры засцярогі перад пачаткам працы:
(a) Калі ласка, выкарыстоўвайце аднаразовыя наканечнікі ў працэсе эксперыменту і змяняйце наканечнікі, калі паглынаеце іншы рэагент.
(b) Пераканайцеся, што ўсе інструменты чыстыя.
(c) Захоўвайце ўзор тканіны ў замарожаным стане.
(d) Падрыхтаваны ўзор павінен быць выкарыстаны для аналізу адразу.
8.2 Тканіна жывёл (курыца, свініна і г.д.)
----Гамагенізуйце ўзор з дапамогай гомогенизатора;
---- Вазьміце 2,0±0,05 г гамагенату ў 50-мл полістырольную цэнтрыфужную прабірку;дадаць 2 мл 0,2 М PB (рашэнне1), падтрасіце, каб растварыцца, затым дадайце 8 мл этылацэтату і моцна падтрасіце на працягу 3 хвілін;
---- Цэнтрыфуга для падзелу: 3000 г / тэмпература навакольнага асяроддзя / 5 мін.
----Перанесці 4 мл супернатанта арганічнай фазы ў шкляную прабірку аб'ёмам 10 мл, высушыць на вадзяной лазні пры тэмпературы 50-60 ℃ пад струменем азоту;
----Растворыце сухія рэшткі ў 1 мл н-гексана, змяшайце на 30 с для растварэння, а затым дадайце 1 мл экстракцыйнага раствора (рашэнне2), змяшаць на вортэкс на працягу 1 хвіліны.цэнтрыфуга для падзелу: 3000 г / тэмпература навакольнага асяроддзя / 5 мін
---- Выдаліць надосадочную фазу н-гексану;вазьміце 50 мкл воднай фазы субстрата для аналізу.
Каэфіцыент развядзення: 1
8.2 Малако
---- Вазьміце 100 мкл пробы сырога малака, змяшайце з 900 мкл экстракцыйнага раствора (рашэнне2) і цалкам змяшаць.
---- Вазьміце 50 мкл прыгатаванага раствора для аналізу.
Каэфіцыент развядзення: 10
9. Працэс аналізу
9.1 Заўвага перад аналізам
9.1.1Пераканайцеся, што ўсе рэагенты і мікралункі маюць пакаёвую тэмпературу (20-25 ℃).
9.1.2Вярніце ўсе астатнія рэагенты ў 2-8℃адразу пасля выкарыстання.
9.1.3Правільнае прамыванне мікралунак з'яўляецца важным этапам у працэсе аналізу;гэта жыццёва важны фактар для ўзнаўлення аналізу ELISA.
9.1.4 Авыключыце святло і накрыйце мікралункі падчас інкубацыі.
9.2 Этапы аналізу
9.2.1 Дастаньце ўсе рэагенты пры пакаёвай тэмпературы (20-25 ℃) больш чым на 30 хвілін, асцярожна ўзбоўтайце перад выкарыстаннем.
9.2.2 Дастаньце неабходныя мікралункі і неадкладна вярніце астатнія ў пакет на маланкі пры тэмпературы 2-8 ℃.
9.2.3. Перад выкарыстаннем разведзены раствор для прамывання трэба нагрэць да пакаёвай тэмпературы.
9.2.4нумар:Пранумаруйце кожную пазіцыю мікралункі і ўсе стандарты і ўзоры павінны быць праведзены ў двух экземплярах.Запішыце пазіцыі стандартаў і ўзораў.
9.2.5Add стандартны раствор/узор і раствор антыцелаў: Дадайце 50 мкл стандартнага раствора((камплект прадастаўляецца)) або падрыхтаваны ўзор у адпаведныя лункі.Дадайце 50 мкл раствора антыцелаў (камплект прадастаўляецца).Акуратна змяшайце, падтрасаючы пласціну ўручную, і інкубуйце 30 хвілін пры 37 ℃ пад вечкам.
9.2.6памыцца: Акуратна зніміце вечка, ачысціце вадкасць з лунак і прамыйце лункі 250 мкл разведзенага раствора для прамывання (рашэнне3) з інтэрвалам 10с па 4-5раз.Убярыце рэшткі вады ўбіраючай паперай (астатнія бурбалкі паветра можна выдаліць нявыкарыстаным наканечнікам).
9.2.7Дадаць ферментны кан'югат: Дадаць 100 мл раствора кан'югата фермента (камплект прадастаўляецца) у кожную лунку, акуратна змяшайце і інкубуйце 30 хвілін пры 37 ℃ пад вечкам.Паўтарыце этап мыцця яшчэ раз.
9.2.8Афарбоўка: Дадаць 50 мкл раствора A(камплект прадастаўляецца) і 50 мкл раствора B(камплект прадастаўляецца) у кожную лунку.Акуратна змяшайце і інкубуйце 15 хвілін пры 37 ℃ пад вечкам.
9.2.9Вымерайце: Дадайце 50 мкл стоп-раствору (камплект прадастаўляецца) у кожную лунку.Акуратна змяшайце і вымерайце паглынанне пры 450 нм (рэкамендуецца вымяраць з падвойнай даўжынёй хвалі 450/630 нм. Прачытайце вынік на працягу 5 хвілін пасля дадання стоп-раствора).
10. Вынікі
10.1 Працэнтнае паглынанне
Сярэднія значэнні значэнняў абсорбцыі, атрыманыя для стандартаў і ўзораў, дзеляцца на значэнне абсорбцыі першага стандарту (нулявы стандарт) і памнажаюцца на 100%.Такім чынам, нулявы стандарт робіцца роўным 100%, а значэнні абсорбцыі прыведзены ў працэнтах.
B
Абсорбцыя (%) = —— ×100%
B0
B ——стандарт паглынання (або ўзор)
B0 ——нулявы стандарт абсорбцыі
10.2 Стандартная крывая
----Каб намаляваць стандартную крывую: адкладзеце значэнне паглынання стандартаў па восі ординат, паўлагарыфмічнае ад канцэнтрацыі стандартнага раствора тылазіну (ppb) па восі х.
---- Канцэнтрацыя тылазіну ў кожным узоры (ppb), якую можна прачытаць з калібравальнай крывой, памнажаецца на адпаведны каэфіцыент развядзення кожнага ўзору, і атрымліваецца фактычная канцэнтрацыя ўзору.
Звярніце ўвагу:
для аналізу дадзеных распрацавана спецыяльнае праграмнае забеспячэнне, якое можа быць прадастаўлена па запыце.
11. Чуласць, дакладнасць і дакладнасць
Тэст адчувальнасці:1,5 частак на мільярд
Мяжа выяўлення:
Ткані жывёл………………………….……………1,5ppb Малако…………………………………………….....…..15ppb Дакладнасць:
Тканіна жывёл………………………………………80±15%
Малако……………………………………..……….……80±10%
Дакладнасць:
Каэфіцыент варыяцыі набору ІФА менш за 10%.
12. Заўвага
12.1 Сярэднія значэнні значэнняў абсорбцыі, атрыманыя для стандартаў і ўзораў, будуць зніжаны, калі рэагенты і ўзоры не былі даведзены да пакаёвай тэмпературы (20-25 ℃).
12.2 Не дазваляйце мікралункам высыхаць паміж этапамі, каб пазбегнуць няўдалай узнаўлення, і выконвайце наступны этап адразу пасля таго, як пастукаеце па трымальніку мікралунак.
12.3 Акуратна ўзбоўтайце кожны рэагент перад выкарыстаннем.
12.4 Трымайце скуру далей ад стоп-раствора, бо ён роўны 0,5 МН2SO4рашэнне.
12.5 Не выкарыстоўвайце састарэлыя наборы.Не мяняйце рэагенты розных партый, інакш адчувальнасць знізіцца.
12.6 Захоўвайце наборы ІФА пры тэмпературы 2-8 ℃, не замарожвайце.Запячатайце пласціны з мікралункамі, пазбягайце прамых сонечных прамянёў падчас усіх інкубацый.Рэкамендуецца накрываць мікратытрацыйныя пласціны.
12.7 Ад раствора субстрата варта адмовіцца, калі ён афарбуецца.Рэагенты могуць сапсавацца, калі значэнне паглынання (450/630 нм) нулявога стандарту менш за 0,5 (A450 нм<0,5).
12.8 Рэакцыі афарбоўвання патрабуецца 15 хвілін пасля дадання раствора А і раствора В. І вы можаце падоўжыць дыяпазон часу інкубацыі да 20 хвілін або больш, калі колер занадта светлы для вызначэння.Ніколі не перавышайце 30 хвілін, наадварот, правільна скарачайце час інкубацыі.
12.9 Аптымальная тэмпература рэакцыі - 37 ℃.Больш высокая або больш нізкая тэмпература прывядзе да змены значэнняў адчувальнасці і паглынання.
13. Захоўванне
Умовы захоўвання: 2-8 ℃.
Тэрмін захоўвання: 12 месяцаў.
