Mededingende Ensiem Immunoassay Kit vir Kwantitatiewe Analise van Tylosin
Mededingende Ensiem Immunoassay Kit vir
Kwantitatiewe Analise vanTylosin
1. Agtergrond
Tylosinis 'n makrolied-antibiotikum, wat hoofsaaklik as antibakteriese en anti-mikoplasma toegedien word.Streng MRL's is vasgestel aangesien hierdie middel tot ernstige newe-effek in sekere groepe kan lei.
Hierdie stel is 'n nuwe produk gebaseer op ELISA-tegnologie, wat vinnig, maklik, akkuraat en sensitief is in vergelyking met algemene instrumentele analise en net 1,5 uur in een operasie benodig, dit kan die werkingsfoute en werkintensiteit aansienlik verminder.
2. Toetsbeginsel
Hierdie stel is gebaseer op indirekte mededingende ELISA-tegnologie.Die mikrotiterputte is bedek met koppelantigeen.Tylosienresidu in die monster kompeteer met die antigeen wat op die mikrotiterplaat bedek is vir die teenliggaam.Na die byvoeging van ensiem-gemerkte anti-teenliggaampies, word TMB-substraat gebruik om die kleur te wys.Absorbansie van die monster is negatief verwant aan die tillosien daarin, na vergelyking met die Standaardkurwe, vermenigvuldig met die verdunningsfaktor, kan tillosienresidue in die monster bereken word.
3. Aansoeke
Hierdie stel kan gebruik word in kwantitatiewe en kwalitatiewe ontleding van tylosienresidu in diereweefsel (hoender, varkvleis, eend) en melk, heuning, eier, ens.
4. Kruisreaksies
Tylosin………………………………………………………..100%
Tilmikosien………………………………………………………<2%
5. Materiaal benodig
5.1 Toerusting:
---- Mikrotiterplaatspektrofotometer (450nm/630nm)
---- Roterende verdamper of stikstofdrooginstrumente
----homogeniseerder
----Shaker
----Sentrifugeer
----Analitiese balans (induktansie: 0.01g)
----Gegradeerde pipet: 10ml
----Rubber pipet gloeilamp
----Volumetriese fles: 10ml
----Polistireen sentrifugeerbuise: 50ml
----Mikropipette: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipet
5.2 Reagense:
----Natriumhidroksied (NaOH, AR)
----Natriumbikarbonaat (NaHCO3,AR)
---- Natriumkarbonaat (NaCO3, AR)
----Trichloorasynsuur (AR)
---- Asetonitriel (AR)
---- Etielasetaat (AR)
┅┅n-heksaan (AR)
----Gedeïoniseerde water
6. Kit komponente
l Mikrotiterplaat met 96 putte bedek met antigeen
l Standaardoplossings (5 bottels, 1 ml/bottel)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking standaard beheer: (1ml/bottel)1 dpm
l Ensiemkonjugaat 1ml………………..…..…rooi doppie
l Teenliggaamoplossing 7ml………………………………groen doppie
l Oplossing A 7ml………………………….….……wit doppie
l Oplossing B 7ml…………………………………..rooi doppie
l Stopoplossing 7ml.……………….……….geel doppie
l 20×gekonsentreerde wasoplossing 40ml
…………………………………..…deursigtige pet
l 4×gekonsentreerde ekstraksieoplossing 50ml
……………………………………………….blou pet
7. Reagense Voorbereiding:
Oplossing 1:0.1mol/L NaOH-oplossing
Weeg 0.4g NaOH tot 100ml gedeïoniseerde water en meng heeltemal.
Oplossing 2: 1mol/L NaOH-oplossing
Weeg 4g NaOH tot 100ml gedeïoniseerde water en meng heeltemal.
Oplossing 3: Karbonaatbuffer sout
Oplossing1: 0,2M PB
Los 51,6 g Na op2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O met gedeïoniseerde water en verdun tot 1000ml.
Oplossing2: Onttrekking oplossing
Verdun die 2×gekonsentreerde ekstraksieoplossing met gedeïoniseerde water in die volumeverhouding van 1:1(bv 10ml 2×ekstraksie oplossing + 10ml gedeïoniseerde water), wat vir monsteronttrekking gebruik sal word,hierdie oplossing kan vir 1 maand by 4 ℃ gestoor word.
Oplossing3: Was oplossing
Verdun die 20×gekonsentreerde wasoplossing met gedeïoniseerde water in die volumeverhouding van 1:19(bv 5ml 20×wasoplossing + 95ml gedeïoniseerde water), wat gebruik sal word om die borde te was.Hierdie oplossing kan vir 1 maand by 4 ℃ gestoor word.
8. Voorbeeldvoorbereidings
8.1 Kennisgewing en voorsorgmaatreëls voor operasie:
(a) Gebruik asseblief eenmalige wenke in die proses van eksperiment, en verander die punte wanneer verskillende reagens absorbeer.
(b) Maak seker dat alle instrumente skoon is.
(c) Hou weefselmonster in vrieskas.
(d) Voorbereide monster moet dadelik vir bepaling gebruik word.
8.2 Diereweefsel (hoender, vark, ens.)
---- Homogeniseer die monster met homogeniseerder;
----Neem 2.0±0.05g homogenaat in 'n 50ml polistireen sentrifugebuis;voeg 2ml van 0.2M PB (oplossing1) , skud om op te los, en voeg dan 8ml etielasetaat by en skud heftig vir 3min;
---- Sentrifuge vir skeiding: 3000g / omgewingstemperatuur / 5min.
---- Dra 4ml van die supernatant organiese fase oor in 'n 10ml glasbuis, droog met 50-60℃ waterbad onder stikstofgasstroom;
---- Los die droë oorskiet op met 1 ml n-heksaan, draai vir 30 sekondes om op te los, en voeg dan 1 ml ekstraksie-oplossing by (oplossing2), draai vir 1 min.sentrifugeer vir skeiding: 3000g / omgewingstemperatuur / 5min
----Verwyder die supernatant n-heksaanfase;neem 50μl van die substraat waterige fase vir toets.
Verdunningsfaktor: 1
8.2 Melk
----Neem 100μl rou melkmonster, meng met 900μl ekstraksieoplossing (oplossing2), en meng heeltemal.
----Neem 50μl van die voorbereide oplossing vir toets.
Verdunningsfaktor: 10
9. Assay proses
9.1 Kennisgewing voor toets
9.1.1Maak seker dat alle reagense en mikroputte by kamertemperatuur (20-25 ℃) is.
9.1.2Plaas al die res reagense terug na 2-8℃onmiddellik na gebruik.
9.1.3Om die mikroputte korrek te was is 'n belangrike stap in die proses van toetsing;dit is die noodsaaklike faktor vir die reproduceerbaarheid van die ELISA-analise.
9.1.4 Amaak die lig leeg en bedek die mikroputte tydens inkubasie.
9.2 Toetsstappe
9.2.1 Haal alle reagense uit by kamertemperatuur (20-25℃) vir meer as 30min, skud liggies voor gebruik.
9.2.2 Haal die nodige mikroputte uit en sit die res onmiddellik terug in die ritssluitsak by 2-8℃.
9.2.3 Die verdunde wasoplossing moet voor gebruik herverhit word om by kamertemperatuur te wees.
9.2.4Nommer:Elke mikroput posisies genommer en alle standaarde en monsters moet in duplikaat uitgevoer word.Teken die standaarde en monsterposisies aan.
9.2.5Add standaardoplossing/monster en teenliggaamoplossing: Voeg 50µl standaardoplossing by ((kit verskaf)) of voorbereide monster na ooreenstemmende putte.Voeg 50µl teenliggaamoplossing by (kit verskaf).Meng liggies deur die plaat met die hand te skud en inkubeer vir 30min by 37℃ met deksel.
9.2.6Was: Verwyder die deksel liggies en suiwer die vloeistof uit die putte en spoel die mikroputte uit met 250µl verdunde wasoplossing (oplossing3) met 'n interval van 10s vir 4-5 keer.Absorbeer die oorblywende water met absorberende papier (die res lugborrel kan met ongebruikte punt uitgeskakel word).
9.2.7Voeg ensiemkonjugaat by: Voeg 100ml ensiemkonjugaatoplossing by (kit verskaf) by elke put, meng liggies en inkubeer vir 30min by 37℃ met deksel.Herhaal die wasstap weer.
9.2.8Kleuring: Voeg 50µl oplossing A(kit verskaf) en 50 µl oplossing B(kit verskaf) aan elke put.Meng liggies en inkubeer vir 15min by 37℃ met deksel.
9.2.9Meet: Voeg 50µl van die stopoplossing by (kit verskaf) aan elke put.Meng liggies en meet die absorpsie by 450nm (Dit word voorgestel met die dubbele golflengte van 450/630nm. Lees die resultaat binne 5min nadat stopoplossing bygevoeg is).
10. Resultate
10.1 Persentasie absorpsie
Die gemiddelde waardes van die absorpsiewaardes wat vir die standaarde en die monsters verkry is, word gedeel deur die absorpsiewaarde van die eerste standaard (nul standaard ) en vermenigvuldig met 100%.Die nulstandaard word dus gelyk aan 100% gemaak en die absorpsiewaardes word in persentasies aangehaal.
B
Absorbansie (%) = —— ×100%
B0
B ——absorpsiestandaard (of monster)
B0 ——absorpsie nul standaard
10.2 Standaardkurwe
----Om 'n standaardkromme te teken: Neem die absorpsiewaarde van standaarde as y-as, semi-logaritmies van die konsentrasie van die tylosienstandaardoplossing (ppb) as x-as.
----Die tylosienkonsentrasie van elke monster (ppb), wat vanaf die kalibrasiekurwe gelees kan word, word vermenigvuldig met die ooreenstemmende verdunningsfaktor van elke monster wat gevolg word, en die werklike konsentrasie van die monster word verkry.
Neem asseblief kennis:
spesiale sagteware is ontwikkel vir data-analise, wat op aanvraag verskaf kan word.
11. Sensitiwiteit, akkuraatheid en akkuraatheid
Toetsgevoeligheid:1,5 ppb
Bespeuringslimiet:
Diereweefsel……………………………….…………………1.5ppb Melk…………………………………………………………………..15ppb Akkuraatheid:
Diereweefsel………………………………………………80±15%
Melk…………………………………………..……….……80±10%
Presisie:
Variasiekoëffisiënt van die ELISA-stel is minder as 10%.
12. Kennisgewing
12.1 Die gemiddelde waardes van die absorpsiewaardes verkry vir die standaarde en die monsters sal verminder word indien die reagense en monsters nie tot kamertemperatuur (20-25℃) gereguleer is nie.
12.2 Moenie toelaat dat mikroputte tussen stappe droog word nie om onsuksesvolle reproduceerbaarheid te vermy en voer die volgende stap onmiddellik uit nadat die mikroputtehouer getik is.
12.3 Skud elke reagens liggies voor gebruik.
12.4 Hou jou vel weg van die stopoplossing, want dit is 0,5MH2SO4oplossing.
12.5 Moenie die kits verouderd gebruik nie.Moenie die reagense van verskillende groepe omruil nie, anders sal dit die sensitiwiteit verlaag.
12.6 Hou die ELISA-stelle by 2-8℃, moenie vries nie.Seël rus mikroput plate, Vermy reguit sonlig tydens alle inkubasies.Dit word aanbeveel om die mikrotiterplate te bedek.
12.7 Substraatoplossing moet laat vaar word as dit verkleur.Die reagense kan sleg word as die absorpsiewaarde (450/630nm) van die nulstandaard minder as 0.5 (A450nm<0.5) is.
12.8 Die kleurreaksie benodig 15 minute na die byvoeging van oplossing A en oplossing B. En jy kan die inkubasietydreekse verleng na 20min of meer as die kleur te lig is om te bepaal.Moet nooit 30min oorskry nie, inteendeel, verkort die inkubasietyd behoorlik.
12.9 Die optimale reaksietemperatuur is 37℃.Hoër of laer temperatuur sal lei tot veranderinge in sensitiwiteit en absorpsiewaardes.
13. Berging
Bergingstoestand: 2-8 ℃.
Bergingstydperk: 12 maande.
