məhsul

1. Fon

Tylosinəsasən antibakterial və antimikoplazma kimi tətbiq olunan makrolid antibiotikdir.Bu dərman müəyyən qruplarda ciddi yan təsirlərə səbəb ola biləcəyi üçün ciddi MRL-lər müəyyən edilmişdir.

Bu dəst ELISA texnologiyasına əsaslanan, ümumi instrumental analizlə müqayisədə sürətli, asan, dəqiq və həssas olan və bir əməliyyatda cəmi 1,5 saat tələb edən yeni məhsuldur, əməliyyat xətasını və iş intensivliyini əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər.

2. Test Prinsipi

Bu dəst dolayı rəqabətli ELISA texnologiyasına əsaslanır.Mikrotiter quyuları birləşdirici antigenlə örtülmüşdür.Nümunədəki tilozin qalığı antikor üçün mikrotiter lövhəsi ilə örtülmüş antigenlə rəqabət aparır.Anti-antikor etiketli ferment əlavə edildikdən sonra rəngi göstərmək üçün TMB substratı istifadə olunur.Nümunənin udulması onun tərkibində olan tilozinlə mənfi əlaqədədir, Standart əyri ilə müqayisə edildikdən sonra seyreltmə əmsalı ilə vurulan nümunədəki tilozinin qalıq miqdarı hesablana bilər.

3. Proqramlar

Bu dəst heyvan toxumasında (toyuq, donuz əti, ördək) və süd, bal, yumurta və s.-də tilozin qalıqlarının kəmiyyət və keyfiyyət analizində istifadə oluna bilər.

4. Çarpaz reaksiyalar

Tylosin……………………………………………..100%

Tilmikozin……………………………………………<2%

5. Tələb olunan materiallar

5.1 Avadanlıqlar:

----Mikrotitr lövhə spektrofotometri (450nm/630nm)

---- Fırlanan buxarlandırıcı və ya azot qurutma cihazları

----homogenizator

----Şəkər

----Sentrifuqa

---- Analitik tarazlıq (induktivlik: 0,01 q)

----Məqsədli pipet: 10ml

----Rezin pipet lampası

---- Həcmli kolba: 10ml

----Polistirol sentrifuqa boruları: 50ml

----Mikropipetlər: 20-200ml, 100-1000ml

250 ml multipipet

5.2 Reagentlər:

----Natrium hidroksid (NaOH, AR)

----Natrium bikarbonat (NaHCO_3,AR)

---- Natrium karbonat (NaCO₃, AR)

---- Trikloroasetik turşu (AR)

---- Asetonitril (AR)

----Etil asetat (AR)

┅┅n-Heksan (AR)

---- Deionlaşdırılmış su

6. Kit Komponentləri

l Antigenlə örtülmüş 96 quyu olan mikrotitr lövhəsi

l Standart məhlullar (5 şüşə, 1ml/şüşə)

0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb

l Spiking standart nəzarət: (1ml/şüşə)1 ppm

l Ferment konjugatı 1ml…………………….…qırmızı qapaq

l Antikor məhlulu 7ml……………….……yaşıl qapaq

l Həll A 7ml…………………….….……ağ qapaq

l Həll B 7ml……………………………..qırmızı qapaq

l Stop məhlulu 7ml.……………….……….sarı qapaq

l 20×konsentratlı yuma məhlulu 40ml

…………………………………..…şəffaf papaq

l 4×konsentratlı ekstraksiya məhlulu 50ml

………………………………………………….mavi papaq

7. Reagentlərin hazırlanması:

Həll 1:0,1mol/l NaOH məhlulu

100 ml deionlaşdırılmış suya 0,4 q NaOH çəkin və tamamilə qarışdırın.

Həll 2: 1mol/L NaOH məhlulu

100 ml deionlaşdırılmış suya 4 q NaOH çəkin və tamamilə qarışdırın.

Həll 3: Karbonat tampon duzu

Həll1: 0.2M PB

51,6 q Na-nı həll edin₂HPO₄·12H₂O, 8,7 q NaH₂PO₄·2H₂O deionlaşdırılmış su ilə qarışdırın və 1000 ml-ə qədər seyreltin.

Həll2: Ekstraksiya məhlulu

2 x konsentratlı ekstraksiya məhlulunu 1:1 həcm nisbətində deionlaşdırılmış su ilə seyreltin.məsələn, 10ml 2×ekstraksiya məhlulu + 10ml deionlaşdırılmış su), nümunənin çıxarılması üçün istifadə ediləcək,bu məhlul 4°C temperaturda 1 ay saxlanıla bilər.

Həll3: Yuma məhlulu

20 x konsentratlı yuma məhlulunu 1:19 həcm nisbətində deionlaşdırılmış su ilə seyreltin(məsələn, 5ml 20×yuma məhlulu + 95ml deionlaşdırılmış su), plitələrin yuyulması üçün istifadə ediləcək.Bu məhlul 4°C temperaturda 1 ay saxlanıla bilər.

8. Nümunə Hazırlıqları

8.1 Əməliyyatdan əvvəl xəbərdarlıq və ehtiyat tədbirləri:

(a) Təcrübə prosesində birdəfəlik məsləhətlərdən istifadə edin və müxtəlif reagentləri uduqda ucları dəyişdirin.

(b) Bütün alətlərin təmiz olduğundan əmin olun.

(c) Toxuma nümunəsini dondurucuda saxlayın.

(d) Hazırlanmış nümunə dərhal analiz üçün istifadə edilməlidir.

8.2 Heyvan toxuması (toyuq, donuz əti və s.)

----Nümunəni homogenizatorla homogenləşdirin;

----2,0±0,05q homogenatdan 50ml polistirol sentrifuqa borusuna alın;2ml 0,2M PB əlavə edin (həll1) , həll etmək üçün silkələyin və sonra 8 ml etil asetat əlavə edin və 3 dəqiqə ərzində şiddətlə silkələyin;

----Ayrılma üçün sentrifuqa: 3000q / ətraf mühitin temperaturu / 5 dəq.

---- 4 ml supernatant üzvi fazasını 10 ml şüşə boruya köçürün, azot qazı axını altında 50-60 ℃ su banyosu ilə qurudun;

---- Quru qalığı 1 ml n-heksanla həll edin, həll etmək üçün 30 saniyə burulğan edin və sonra 1 ml ekstraksiya məhlulu əlavə edin (həll2), 1 dəqiqə burulğan edin.ayırmaq üçün sentrifuqa: 3000q / ətraf mühitin temperaturu / 5 dəq

---- Supernatant n-heksan fazasını çıxarın;analiz üçün substratın sulu fazasından 50μl götürün.

Seyreltmə əmsalı: 1

8.2 Süd

---- 100μl xam süd nümunəsi götürün, 900μl ekstraksiya məhlulu ilə qarışdırın (həll2) və tamamilə qarışdırın.

---- Təhlil üçün hazırlanmış məhluldan 50μl götürün.

Seyreltmə əmsalı: 10

9. Təhlil prosesi

9.1 Təhlildən əvvəl xəbərdarlıq

9.1.1Bütün reagentlərin və mikro quyuların hamısının otaq temperaturunda (20-25 ℃) olduğundan əmin olun.

9.1.2Bütün qalan reagentləri 2-8-ə qaytarın℃istifadə edildikdən dərhal sonra.

9.1.3Mikro quyuların düzgün yuyulması analiz prosesində mühüm addımdır;bu, ELISA analizinin təkrar istehsalı üçün vacib amildir.

9.1.4 Aişığı ləğv edin və inkubasiya zamanı mikro quyuları örtün.

9.2 Təhlil addımları

9.2.1 Bütün reagentləri otaq temperaturunda (20-25 ℃) 30 dəqiqədən çox çıxarın, istifadə etməzdən əvvəl yumşaq silkələyin.

9.2.2 Lazım olan mikro quyuları çıxarın və qalanlarını dərhal 2-8 ℃ temperaturda kilidli çantaya qaytarın.

9.2.3 İstifadədən əvvəl seyreltilmiş yuma məhlulu otaq temperaturunda yenidən qızdırılmalıdır.

9.2.4Nömrə:Hər bir mikroquyuğun mövqeləri nömrələnmiş və bütün standartlar və nümunələr iki nüsxədə işlənməlidir.Standartları və nümunə mövqelərini qeyd edin.

9.2.5Add standart məhlul/nümunə və antikor məhlulu: 50µl standart məhlul əlavə edin((dəsti verilir)) və ya müvafiq quyulara hazırlanmış nümunə.50µl antikor məhlulu əlavə edin(dəsti verilir).Plitəni əl ilə silkələməklə yumşaq qarışdırın və qapaq ilə 37°C temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya edin.

9.2.6Yuyun: Qapağı yumşaq bir şəkildə çıxarın və mayeni quyulardan təmizləyin və mikro quyuları 250 µl seyreltilmiş yuma məhlulu ilə yuyun (həll3) 10 saniyə aralığında 4-5 dəfə.Qalıq suyu uducu kağızla udun (qalan hava qabarcığını istifadə olunmamış uc ilə çıxarmaq olar).

9.2.7Enzim konjugatı əlavə edin: 100 ml ferment konjugat məhlulu əlavə edin(dəsti verilir) hər quyuya yumşaq bir şəkildə qarışdırın və qapaq ilə 37°C temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya edin.Yuma addımını yenidən təkrarlayın.

9.2.8Rənglənmə: 50µl A məhlulu əlavə edin(dəsti verilir) və 50µl məhlul B(dəsti verilir) hər quyuya.Yavaşca qarışdırın və qapaq ilə 37°C temperaturda 15 dəqiqə inkubasiya edin.

9.2.9Ölçmək: 50µl dayandırıcı məhlul əlavə edin(dəsti verilir) hər quyuya.Yavaşca qarışdırın və uduculuğu 450nm-də ölçün (450/630nm ikili dalğa uzunluğu ilə ölçülməsi tövsiyə olunur. Dayanma məhlulu əlavə edildikdən sonra 5 dəqiqə ərzində nəticəni oxuyun).

10. Nəticələr

10.1 Faiz absorbsiyası

Standartlar və nümunələr üçün alınmış absorbsiya qiymətlərinin orta dəyərləri birinci standartın absorbsiya dəyərinə (sıfır standart) bölünür və 100%-ə vurulur.Beləliklə, sıfır standartı 100%-ə bərabər tutulur və absorbans dəyərləri faizlə ifadə edilir.

B

Absorbsiya (%) = —— ×100%

B0

B ——udma standartı (və ya nümunə)

B0 ——udma sıfır standartı

10.2 Standart əyri

----Standart əyri çəkmək üçün: Standartların udma dəyərini y oxu kimi, tilozin standart məhlulunun (ppb) konsentrasiyasının yarı loqarifmikini x oxu kimi götürün.

----Kalibrləmə əyrisindən oxuna bilən hər bir nümunənin tilozin konsentrasiyası (ppb) izlənilən hər bir nümunənin müvafiq Seyreltmə əmsalı ilə vurulur və nümunənin faktiki konsentrasiyası əldə edilir.

Diqqət yetirin:

məlumatların təhlili üçün xüsusi proqram təminatı işlənib hazırlanmışdır ki, bu da sorğu əsasında təqdim edilə bilər.

11. Həssaslıq, dəqiqlik və dəqiqlik

Test Həssaslığı:1,5 ppb

Aşkarlama limiti:

Heyvan toxuması…………………………………………1.5ppb Süd…………………………………………………..15ppb Dəqiqlik:

Heyvan toxuması………………………………………80±15%

Süd…………………………………………………………80±10%

Dəqiqlik:

ELISA dəstinin dəyişmə əmsalı 10%-dən azdır.

12. Qeyd

12.1 Reagentlər və nümunələr otaq temperaturuna (20-25 ℃) qədər tənzimlənmədikdə, standartlar və nümunələr üçün alınmış absorbans dəyərlərinin orta dəyərləri azalacaq.

12.2 Uğursuz təkrarlanmanın qarşısını almaq üçün mikro quyuların addımlar arasında qurumasına icazə verməyin və mikroquyuların saxlayıcısına toxunduqdan dərhal sonra növbəti addımı işə salın.

12.3 İstifadə etməzdən əvvəl hər bir reagenti yumşaq silkələyin.

12.4 Dərinizi dayandırıcı məhluldan uzaq tutun, çünki 0,5 MH₂SO₄həll.

12.5 Vaxtı keçmiş dəstlərdən istifadə etməyin.Müxtəlif partiyaların reagentlərini dəyişdirməyin, əks halda həssaslığı aşağı salacaq.

12.6 ELISA dəstlərini 2-8 ℃ temperaturda saxlayın, dondurmayın.Mikro quyu boşqablarını bağlayın, bütün inkubasiyalar zamanı düz günəş işığından çəkinin.Mikrotitr plitələrinin örtülməsi tövsiyə olunur.

12.7 Substrat məhlulu rənglərə çevrilərsə, ondan imtina edilməlidir.Sıfır standartın udma dəyəri (450/630nm) 0,5-dən (A450nm<0,5) az olarsa, reagentlər pisləşə bilər.

12.8 Rənglənmə reaksiyasına A məhlulu və B məhlulu əlavə edildikdən sonra 15 dəqiqə lazımdır. Rəng müəyyən etmək üçün çox açıqdırsa, inkubasiya müddətini 20 dəqiqə və ya daha çox uzatmaq olar.Heç vaxt 30 dəqiqədən çox olmayın, əksinə, inkubasiya müddətini düzgün şəkildə qısaltın.

12.9 Optimal reaksiya temperaturu 37℃-dir.Yüksək və ya aşağı temperatur həssaslıq və absorbans dəyərlərinin dəyişməsinə səbəb olacaq.

13. Saxlama

Saxlama şəraiti: 2-8 ℃.

Saxlama müddəti: 12 ay.