Kit d'immunoassaig enzimàtic competitiu per a l'anàlisi quantitativa de la tilosina
Kit d'immunoassaig enzimàtic competitiu per a
Anàlisi quantitativa deTilosina
1. Antecedents
Tilosinaés un antibiòtic macròlid, que s'aplica principalment com a antibacterià i antimicoplasma.S'han establert LMR estrictes ja que aquest fàrmac pot provocar efectes secundaris greus en determinats grups.
Aquest kit és un nou producte basat en la tecnologia ELISA, que és ràpid, fàcil, precís i sensible en comparació amb l'anàlisi instrumental habitual i només necessita 1,5 hores en una operació, pot minimitzar considerablement l'error de funcionament i la intensitat del treball.
2. Principi de prova
Aquest kit es basa en la tecnologia ELISA de competició indirecta.Els pous de microtitulació estan recoberts amb antigen d'acoblament.El residu de tilosina a la mostra competeix amb l'antigen recobert a la placa de microtitulació per a l'anticòs.Després de l'addició d'un anticòs marcat amb enzim, s'utilitza el substrat TMB per mostrar el color.L'absorció de la mostra està relacionada negativament amb la tilosina que hi resideix, després de comparar-la amb la corba estàndard, multiplicada pel factor de dilució, es pot calcular la quantitat de residus de tilosina a la mostra.
3. Aplicacions
Aquest kit es pot utilitzar en l'anàlisi quantitativa i qualitativa de residus de tilosina en teixits animals (pollastre, porc, ànec) i llet, mel, ou, etc.
4. Reaccions creuades
Tilosina………………………………………………………..100%
Tilmicosina……………………………………………………<2%
5. Materials necessaris
5.1 Equipaments:
---- Espectrofotòmetre de placa de microtitulació (450nm/630nm)
----Evaporador rotatiu o instruments d'assecat de nitrogen
----homogeneïtzador
----Agitador
----Centrífuga
---- Balanç analític (inductància: 0,01 g)
----Pipeta graduada: 10ml
---- Bombeta de pipeta de goma
----Flascó aforat: 10ml
----Tubs de centrífuga de poliestirè: 50ml
----Micropipetes: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multippette
5.2 Reactius:
----Hidròxid de sodi (NaOH, AR)
---- Bicarbonat de sodi (NaHCO3,AR)
---- Carbonat de sodi (NaCO3, AR)
----Àcid tricloroacètic (AR)
---- Acetonitril (AR)
----Acetat d'etil (AR)
┅┅n-hexà (AR)
----Aigua desionitzada
6. Components del kit
l Placa de microtitulació amb 96 pous recoberts amb antigen
l Solucions estàndard (5 ampolles, 1 ml/ampolla)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Control estàndard de punxada: (1 ml/ampolla)1 ppm
l Conjugat enzimàtic 1ml……………..…..…cap vermell
l Solució d'anticossos 7ml………………………………tap verd
l Solució A 7ml…………………….….……tap blanc
l Solució B 7ml………………………………..tap vermell
l Solució d'aturada 7ml.……………….……….tap groc
l 20×solució de rentat concentrada 40ml
…………………………………………..…tapa transparent
l 4×solució d'extracció concentrada 50ml
……………………………………………………….gorra blava
7. Preparació dels reactius:
Solució 1:Solució de NaOH 0,1 mol/L
Pesar 0,4 g de NaOH a 100 ml d'aigua desionitzada i barrejar completament.
Solució 2: solució de NaOH 1mol/L
Pesar 4 g de NaOH a 100 ml d'aigua desionitzada i barrejar completament.
Solució 3: Sal tampó carbonatada
Solució1: 0,2 M PB
Dissoleu 51,6 g de Na2HPO4· 12H2O, 8,7 g de NaH2PO4· 2H2O amb aigua desionitzada i diluir a 1000 ml.
Solució2: Solució d'extracció
Diluïu la solució d'extracció concentrada 2 × amb aigua desionitzada en una proporció de volum d'1:1 (p. ex. 10 ml de solució d'extracció 2 × + 10 ml d'aigua desionitzada), que s'utilitzarà per a l'extracció de mostres,aquesta solució es pot emmagatzemar a 4 ℃ durant 1 mes.
Solució3: solució de rentat
Dilueix la solució de rentat concentrada 20 × amb aigua desionitzada en una proporció de volum d'1:19 (p. ex. 5 ml de solució de rentat 20 × + 95 ml d'aigua desionitzada), que servirà per rentar els plats.Aquesta solució es pot emmagatzemar a 4 ℃ durant 1 mes.
8. Preparacions de mostres
8.1 Avís i precaucions abans de l'operació:
(a) Si us plau, utilitzeu consells únics en el procés de l'experiment i canvieu les puntes quan absorbeixi diferents reactius.
(b) Assegureu-vos que tots els instruments estiguin nets.
(c) Mantenir la mostra de teixit congelada.
(d) La mostra preparada s'ha d'utilitzar per a l'assaig alhora.
8.2 Teixit animal (pollastre, porc, etc.)
----Homogeneïtzar la mostra amb homogeneïtzador;
---- Agafeu 2,0 ± 0,05 g d'homogeneïtat en un tub de centrífuga de poliestirè de 50 ml;afegir 2 ml de 0,2 M PB (solució1), agiteu per dissoldre's i, a continuació, afegiu 8 ml d'acetat d'etil i agiteu amb força durant 3 minuts;
----Centrífuga per a la separació: 3000g / temperatura ambient / 5min.
---- Transferiu 4 ml de la fase orgànica sobrenedant a un tub de vidre de 10 ml, assequeu-lo amb un bany d'aigua de 50-60 ℃ sota un corrent de gas nitrogenat;
---- Dissoleu les restes seques amb 1 ml de n-hexà, agitar durant 30 segons per dissoldre i, a continuació, afegiu 1 ml de solució d'extracció (solució2), vortex durant 1 min.centrífuga per a la separació: 3000g / temperatura ambient / 5min
----Elimineu la fase n-hexà sobrenedant;Preneu 50 μl de la fase aquosa del substrat per a l'assaig.
Factor de dilució: 1
8.2 Llet
---- Agafeu 100 μl de mostra de llet crua, barregeu amb 900 μl de solució d'extracció (solució2), i barrejar completament.
----Agafeu 50 μl de la solució preparada per a l'assaig.
Factor de dilució: 10
9. Procés d'assaig
9.1 Avís abans de l'assaig
9.1.1Assegureu-vos que tots els reactius i micropous estiguin a temperatura ambient (20-25 ℃).
9.1.2Torneu tots els reactius restants a 2-8℃immediatament després de l'ús.
9.1.3Rentar correctament els micropous és un pas important en el procés d'assaig;és el factor vital per a la reproductibilitat de l'anàlisi ELISA.
9.1.4 Abuidar la llum i tapar els micropouets durant la incubació.
9.2 Passos de l'assaig
9.2.1 Traieu tots els reactius a temperatura ambient (20-25 ℃) durant més de 30 minuts, agiteu suaument abans d'utilitzar-los.
9.2.2 Traieu els micropous necessaris i torneu la resta a la bossa amb cremallera a 2-8 ℃ immediatament.
9.2.3 La solució de rentat diluïda s'ha de tornar a escalfar perquè estigui a temperatura ambient abans d'utilitzar-la.
9.2.4Número:Les posicions numerades de cada micropout i tots els estàndards i mostres s'han d'executar per duplicat.Anoteu els estàndards i les posicions de les mostres.
9.2.5Add solució estàndard/mostra i solució d'anticossos: Afegiu 50 µl de solució estàndard ((equip proporcionat)) o mostra preparada als pous corresponents.Afegiu 50 µl de solució d'anticossos (equip proporcionat).Barrejar suaument agitant la placa manualment i incubar durant 30 minuts a 37 ℃ amb tapa.
9.2.6Rentar: Traieu suaument la coberta i purifiqueu el líquid dels pous i esbandiu els micropous amb 250 µl de solució de rentat diluïda (solució3) a intervals de 10 segons durant 4-5 vegades.Absorbiu l'aigua residual amb paper absorbent (la bombolla d'aire restant es pot eliminar amb la punta no utilitzada).
9.2.7Afegiu el conjugat enzimàtic: Afegiu 100 ml de solució de conjugat enzimàtic (equip proporcionat) a cada pou, barrejar suaument i incubar durant 30 minuts a 37 ℃ amb tapa.Repetiu el pas de rentat de nou.
9.2.8Coloració: Afegiu 50 µl de solució A(equip proporcionat) i 50µl de solució B(equip proporcionat) a cada pou.Barrejar suaument i incubar durant 15 minuts a 37 ℃ amb tapa.
9.2.9Mesura: Afegiu 50 µl de la solució de parada (equip proporcionat) a cada pou.Barregeu suaument i mesureu l'absorbància a 450 nm (es recomana mesurar amb la longitud d'ona dual de 450/630 nm. Llegiu el resultat en 5 minuts després d'afegir la solució de parada).
10. Resultats
10.1 Percentatge d'absorbància
Els valors mitjans dels valors d'absorbància obtinguts per als estàndards i les mostres es divideixen pel valor d'absorbància del primer estàndard (estàndard zero) i es multipliquen pel 100%.Així, l'estàndard zero es fa igual al 100% i els valors d'absorbància es comenten en percentatges.
B
Absorbància (%) = —— × 100%
B0
B ——estàndard d'absorbància (o mostra)
B0 ——absorbància zero estàndard
10.2 Corba estàndard
----Per dibuixar una corba estàndard: pren el valor d'absorbància dels estàndards com a eix y, semi-logarítmica de la concentració de la solució estàndard de tilosina (ppb) com a eix x.
----La concentració de tilosina de cada mostra (ppb), que es pot llegir des de la corba de calibratge, es multiplica pel corresponent factor de dilució de cada mostra seguida i s'obté la concentració real de la mostra.
Si us plau, tingueu en compte:
s'ha desenvolupat un programari especial per a l'anàlisi de dades, que es pot proporcionar a petició.
11. Sensibilitat, exactitud i precisió
Sensibilitat de prova:1,5 ppb
Límit de detecció:
Teixit animal…………………………………………………… 1,5 ppb Llet……………………………………………………………………..15 ppb Precisió:
Teixit animal………………………………………………80±15%
Llet………………………………………..……….……80±10%
Precisió:
El coeficient de variació del kit ELISA és inferior al 10%.
12. Avís
12.1 Els valors mitjans dels valors d'absorbància obtinguts per als estàndards i les mostres es reduiran si els reactius i les mostres no s'han regulat a temperatura ambient (20-25 ℃).
12.2 No deixeu que els micropous s'assequin entre els passos per evitar una reproductibilitat infructuosa i feu servir el següent pas immediatament després de tocar el suport de micropous.
12.3 Agiteu cada reactiu suaument abans del seu ús.
12.4 Mantingueu la pell lluny de la solució de parada perquè és de 0,5MH2SO4solució.
12.5 No utilitzeu els kits obsolets.No intercanvieu els reactius de lots diferents, o en cas contrari reduirà la sensibilitat.
12.6 Mantingueu els kits ELISA a 2-8 ℃, no els congeleu.Segellar les plaques de micropous en repòs, evitar la llum solar directa durant totes les incubacions.Es recomana cobrir les plaques de microtitulació.
12.7 La solució de substrat s'ha d'abandonar si canvia de color.Els reactius es poden tornar malament si el valor d'absorbància (450/630 nm) de l'estàndard zero és inferior a 0,5 (A450nm <0,5).
12.8 La reacció de coloració necessita 15 minuts després de l'addició de la solució A i la solució B. I podeu allargar els intervals de temps d'incubació fins a 20 minuts o més si el color és massa clar per determinar-lo.No supereu mai els 30min, al contrari, reduïu adequadament el temps d'incubació.
12.9 La temperatura de reacció òptima és de 37 ℃.Una temperatura més alta o més baixa comportarà canvis en els valors de sensibilitat i absorbància.
13. Emmagatzematge
Condicions d'emmagatzematge: 2-8 ℃.
Període d'emmagatzematge: 12 mesos.
