hua

1. Papamuri

Tylosinhe paturopi macrolide, e whakamahia ana hei antibacterial me te anti-mycoplasma.Kua whakatauhia nga MRL kaha mai i te mea tera pea ka pa te kino o tenei tarukino ki etahi roopu.

He hua hou tenei kete i runga i te hangarau ELISA, he tere, he ngawari, he tika me te tairongo ki te whakataurite ki te tātari taputapu noa me te hiahia 1.5 haora i roto i te mahi kotahi, ka taea te whakaiti i te hapa mahi me te kaha o te mahi.

2. Tikanga Whakamātautau

Ko tenei kete i ahu mai i te hangarau ELISA whakataetae autaki.Ko nga puna microtiter kua pania ki te antigen hono.Ko te toenga Tylosin i roto i te tauira ka whakataetae ki te antigen kua pania ki te pereti microtiter mo te antibody.Whai muri i te taapiri o te whaariki kua tapaina he anti-antibody, ka whakamahia te tïpako TMB hei whakaatu i te tae.Ko te whakaurunga o te tauira he hononga kino ki te tylosin e noho ana i roto, i muri i te whakatairite ki te Anau Paerewa, ka whakareatia ki te tauwehe waimeha, ka taea te tatau te nui o te toenga tylosin i roto i te tauira.

3. Nga tono

Ka taea te whakamahi i tenei kete ki te tātari ine me te kounga o te toenga tylosin i roto i te kiko kararehe (heihei, poaka, parera) me te miraka, te honi, te hua manu, me era atu.

4. Whakawhitiwhiti

Tilosin……………………………………………………..100%

Tilmicosin………………………………………………<2%

5. Rauemi e hiahiatia ana

5.1 Taputapu:

----Tirohanga paraharaha paraharaha (450nm/630nm)

----Whakaoho hurihuri, taputapu whakamaroke hauota ranei

----whakariterite

----Riri

----Centrifuge

----Paitika tātari (whakauru: 0.01g)

----Pitita Paetahi: 10ml

---- Pupu paipa rapa

---- Puka Puka: 10ml

----Polystyrene centrifuge ngongo: 50ml

----Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml

250ml-whakamaha

5.2 Reagents:

----konutai waihā (NaOH, AR)

----Sodium bicarbonate (NaHCO_3,AR)

---- Konutai warokawa (NaCO₃, AR)

----Wakawa Trichloroacetic (AR)

---- Acetonitrile (AR)

----Ethyl acetate (AR)

┅┅n-Hexane (AR)

----Wai whakakorehia

6. Waenga Kete

l pereti Microtiter me nga puna 96 kua pania ki te antigen

l Nga otinga paerewa(5 ipu,1ml/pounamu)

0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb

l Te mana whakahaere paerewa: (1ml/pounamu)1ppm

l Huihuinga Enzyme 1ml…………………...potae whero

l otinga Antibody 7ml…………………………..potae matomato

l Otinga A 7ml…………………………………..pee ma

l Otinga B 7ml...……………………………..potae whero

l Whakamutua te otinga 7ml.…………………………………….potae kōwhai

l 20×te otinga horoi horoi 40ml

…………………………………..…puata maramara

l 4×te otinga tangohanga 50ml

…………………………………………….potae kahurangi

7. Whakaritenga Reagents:

Otinga 1:0.1mol/L otinga NaOH

Paunatia te 0.4g NaOH ki te 100ml wai kua whakakorehia, ka uru katoa.

Otinga 2: 1mol/L wairewa NaOH

Paunatia te 4 karamu NaOH ki te 100ml wai kaoona ka uru katoa.

Otinga 3: Te tote parepare waro

Rongoā1: 0.2M PB

Whakarewa 51.6g o Na₂HPO₄·12H₂O, 8.7g o NaH₂PO₄·2H₂O ki te wai deionized ka waimeha ki te 1000ml.

Rongoā2: Te otinga tangohanga

Waimeha i te wairewa tangohanga 2×me te wai deionized i roto i te ōwehenga rōrahi o te 1:1(hei tauira 10ml o te wairewa tangohanga 2× + 10ml o te wai whakaheke), ka whakamahia mo te tango tauira,ka taea te rongoa i tenei otinga ki te 4 ℃ mo te 1 marama.

Rongoā3: Horoi otinga

Ringihia te wairewa horoi 20×me te wai deionized i roto i te ōwehenga rōrahi o te 1:19(hei tauira 5ml o te wairewa horoi horoi 20x + 95ml wai kua whakakorehia), ka whakamahia hei horoi i nga pereti.Ka taea te rongoa i tenei otinga ki te 4 ℃ mo te 1 marama.

8. Tauira Whakaritenga

8.1 Panui me nga whakatupato i mua i te mahi:

(a) Tena koa whakamahi i nga tohutohu kotahi i roto i te mahi whakamatautau, me te huri i nga tohutohu ina uru mai nga reagent rereke.

(b) Me mohio kei te ma katoa nga taputapu.

(c) Purihia te tauira kiko ki roto i te whakatio.

(d) Me whakamahi te tauira kua rite mo te whakamatautau i te wa kotahi.

8.2 Te kiko kararehe (heihei, poaka, aha atu)

----Whakaritea te tauira ki te homogenizer;

---- Tangohia te 2.0±0.05g o te homogenate ki roto i te ngongo polystyrene centrifuge 50ml;tāpirihia te 2ml o te 0.2M PB (otinga1) , ruru kia memeha, katahi ka tapirihia te 8ml o te ethyl acetate ka wiri kaha mo te 3min;

---- Centrifuge mo te wehenga: 3000g / ambient pāmahana / 5min.

----Whakawhitihia te 4ml o te wahanga waro nui ki roto i te ngongo karaihe 10ml, whakamaroke ki te pati wai 50-60 ℃ i raro i te awa hau hauota;

---- Whakarewahia te toenga maroke ki te 1ml o te n-hexane, vortex mo te 30s kia memeha, katahi ka tapirihia te 1ml o te otinga tangohanga (otinga2), vortex mo te 1min.centrifuge mo te wehenga: 3000g / ambient pāmahana / 5min

----Tangohia te wahanga n-hexane supernatant;tango 50μl o te wahanga wai tïpako hei whakamatautau.

Tauwehe waimeha: 1

8.2 Miraka

----Tangohia te 100μl o te tauira miraka mata, uru ki te 900μl o te otinga tangohanga (otinga2), ka uru katoa.

----Tangohia te 50μl o te otinga kua rite mo te whakamatautau.

Tauwehe waimeha: 10

9. Te tukanga whakamatautau

9.1 Panui i mua i te whakamatautau

9.1.1Me mohio kei te noho katoa nga reagents me nga microwell i te pāmahana rūma (20-25 ℃).

9.1.2Whakahokia nga toenga reagents katoa ki te 2-8℃i muri tonu i te whakamahinga.

9.1.3Ko te horoi tika i nga microwells tetahi mahi nui i roto i te mahi whakamatautau;Koia te mea nui ki te whakahoki ano i te tātaritanga ELISA.

9.1.4 Awhakakorehia te rama, ka uhia nga microwells i te wa e heki ana.

9.2 Nga Mahi Whakatau

9.2.1 Tangohia nga reagents katoa ki waho i te pāmahana rūma (20-25 ℃) neke atu i te 30 meneti, ruru ata i mua i te whakamahi.

9.2.2 Kawea mai nga microwells e hiahiatia ana ka whakahoki i te toenga ki roto i te putea raka-kotu i te 2-8 ℃ tonu.

9.2.3 Me whakamahana ano te wairewa horoi waimeha kia noho ki te pāmahana rūma i mua i te whakamahi.

9.2.4Tau:Whakatauhia nga waahi moroiti katoa me nga paerewa me nga tauira katoa me whakahaere kia takirua.Tuhia nga paerewa me nga tuunga tauira.

9.2.5Add otinga paerewa/tauira me te otinga antibody: Tāpirihia te 50µl o te otinga paerewa((kete kua whakaratohia)) he tauira rite ranei ki nga puna e rite ana.Tāpirihia te 50µl o te otinga antibody(kete kua whakaratohia).Whakaranu marietia ma te wiri a ringa i te pereti ka whakamakuku mo te 30 meneti i te 37℃ me te uhi.

9.2.6Horoi: Tango ata te uhi ka purea te wai i roto i nga puna ka horoi i nga microwells ki te 250µl wairewa horoi horoi (otinga3) i te wa o te 10s mo te 4-5 wa.Horoihia te toenga wai me te pepa mimiti (ka taea te whakakore i te toenga o te mirumiru hau me te pito kaore i whakamahia).

9.2.7Tāpirihia te whākōkī conjugate: Tāpirihia he 100ml o te wairewa conjugate enzyme(kete kua whakaratohia) ki ia puna, uru marie ka whakamakuku mo te 30 meneti i te 37 ℃ me te uhi.Whakahokia ano te taahiraa horoi.

9.2.8Tae: Tāpirihia te 50µl o te otinga A(kete kua whakaratohia) me te 50µl o te otinga B(kete kua whakaratohia) ki ia puna.Whakaranu marietia ka whakamakuku mo te 15 meneti i te 37 ℃ me te uhi.

9.2.9Ine: Tāpirihia te 50µl o te otinga mutu(kete kua whakaratohia) ki ia puna.Whakaranu ata me te ine i te horonga ki te 450nm (E whakaarotia ana me ine me te roangaru-rua o 450/630nm. Panuitia te hua i roto i te 5min i muri i te taapiri otinga mutu).

10. Hua

10.1 Te ōrau o te urunga

Ko nga uara toharite o nga uara urunga kua whiwhi mo nga paerewa me nga tauira ka wehewehea e te uara whakauru o te paerewa tuatahi (kore paerewa) ka whakareatia ki te 100%.Ko te paerewa kore ka hangaia kia rite ki te 100% ka whakahuahia nga uara urunga i roto i nga ōrau.

B

Te horonga (%) = —— ×100%

B0

B ——paerewa horonga (tauira ranei)

B0 ——te horomanga kore paerewa

10.2 Anau Paerewa

----Ki te tuhi i te anau paerewa: Tangohia te uara ngongo o nga paerewa hei tuaka-y, hauruarua o te kukū o te otinga paerewa tylosin (ppb) hei tuaka-x.

----Ko te kukū o te tylosin o ia tauira (ppb), ka taea te panui mai i te ananga whakatikatika, ka whakareatia ki te tauwehe Dilution e rite ana o ia tauira ka whai, ka whiwhi te kukū o te tauira.

Kia mahara:

kua whakawhanakehia he rorohiko motuhake mo te tātari raraunga, ka taea te tuku i runga i te tono.

11. Te tairongo, te tika me te tika

Te Tairongo Whakamatau:1.5ppb

Tepe rapunga:

Te kiko kararehe……………………………………………………1.5ppb Miraka………………………………………………………………15ppb Tika:

Te kiko kararehe………………………………………………80±15%

Miraka……………………………………………………..80±10%

Tika:

He iti iho i te 10% te whakarea rereke o te kete ELISA

12. Panui

12.1 Ko nga uara toharite o nga uara urunga ka riro mai mo nga paerewa me nga tauira ka whakaitihia mena kaore ano nga reagents me nga tauira i whakaritea ki te pāmahana rūma (20-25 ℃).

12.2 Kaua e tukua nga poka moroiti kia maroke i waenga i nga hikoinga kia kore ai e taea te whakaputa me te mahi i te mahi e whai ake nei i muri tonu i te paato i te kaipupuri microwells.

12.3 ruru atahia ia reagent i mua i te whakamahi.

12.4 Tiakina to kiri mai i te otinga mutu he 0.5MH₂SO₄otinga.

12.5 Kaua e whakamahia nga kete kua tawhitotia.Kaua e whakawhitia nga reagents o nga roopu rereke, ki te kore ka heke te aro.

12.6 Puritia nga kete ELISA ki te 2-8 ℃, kaua e whakatio.Hirihia nga pereti microwell okiokinga, karohia te ra tika i nga wa katoa o te heki.E taunaki ana kia uhia nga pereti microtiter.

12.7 Me whakarērea te otinga o te papapa ki te huri te tae.Ka kino pea nga reagents ki te iti iho te uara urunga (450/630nm) o te paerewa kore i te 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 Ko te tauhohenga tae me 15min i muri i te taapiri o te otinga A me te otinga B. Ka taea e koe te whakaroa i nga awhe wa inkubasi ki te 20min neke atu ranei mena he maamaa te tae ki te whakatau.Kaua rawa e neke ake i te 30min, engari, whakapotohia te wa incubation tika.

12.9 Ko te pāmahana tauhohenga tino pai ko te 37 ℃.Ko te teitei ake, te iti iho ranei o te pāmahana ka arahi ki nga huringa o te tairongo me nga uara whakauru.

13. Rokiroki

Te ahua rokiroki: 2-8 ℃.

Te wa rokiroki: 12 marama.