Kilpaileva entsyymi-immunomäärityssarja tylosiinin kvantitatiiviseen analyysiin
Kilpailukykyinen entsyymi-immunomäärityssarja
Kvantitatiivinen analyysiTylosiini
1. Tausta
Tylosiinion makrolidiantibiootti, jota käytetään pääasiassa antibakteerisena ja antimykoplasmana.Tiukat jäämien enimmäismäärät on vahvistettu, koska tämä lääke voi aiheuttaa vakavia sivuvaikutuksia tietyissä ryhmissä.
Tämä sarja on uusi ELISA-teknologiaan perustuva tuote, joka on nopea, helppo, tarkka ja herkkä verrattuna yleiseen instrumentaalianalyysiin ja tarvitsee vain 1,5 tuntia yhdessä toimenpiteessä. Se voi minimoida huomattavasti toimintavirheitä ja työn intensiteettiä.
2. Testiperiaate
Tämä sarja perustuu epäsuoraan kilpailevaan ELISA-tekniikkaan.Mikrotiitterikuopat on päällystetty kytkentäantigeenillä.Tylosiinijäännös näytteessä kilpailee mikrotiitterilevylle päällystetyn antigeenin kanssa vasta-aineesta.Entsyymileimatun anti-vasta-aineen lisäämisen jälkeen TMB-substraattia käytetään värin näyttämiseen.Näytteen absorbanssi on negatiivisessa suhteessa siinä olevaan tylosiinijäännökseen. Standardikäyrään verrattuna, kerrottuna laimennuskertoimella, voidaan laskea tylosiinijäämän määrä näytteessä.
3. Sovellukset
Tätä sarjaa voidaan käyttää eläinkudoksen (kana, sianliha, ankka) ja maidon, hunajan, kananmunan jne. tylosiinijäämien kvantitatiiviseen ja laadulliseen analysointiin.
4. Ristireaktiot
Tylosiini…………………………………………………..100 %
Tilmikosiini…………………………………………………<2 %
5. Tarvittavat materiaalit
5.1 Varusteet:
----Mikrotiitterilevyspektrofotometri (450nm/630nm)
---- Pyörivä haihdutin tai typen kuivausvälineet
----homogenisaattori
---- Shaker
----Sentrifugi
----Analyyttinen vaaka (induktanssi: 0,01g)
----Astepipetti: 10 ml
----Kumipipetin polttimo
---- Mittapullo: 10 ml
----Polystyreenisentrifugiputket: 50 ml
----Mikropipetit: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multipipetti
5.2 Reagenssit:
----Natriumhydroksidi (NaOH, AR)
---- Natriumbikarbonaatti (NaHCO3,AR)
---- Natriumkarbonaatti (NaCO3, AR)
---- trikloorietikkahappo (AR)
---- asetonitriili (AR)
----etyyliasetaatti (AR)
┅┅n-heksaani (AR)
---- Deionisoitu vesi
6. Kitin osat
l Mikrotiitterilevy, jossa on 96 kuoppaa, päällystetty antigeenillä
l Vakioliuokset (5 pulloa, 1 ml/pullo)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Piikkien vakiosäädin: (1 ml/pullo)1 ppm
l Entsyymikonjugaatti 1ml………………………………………………………………………………………………………………………
l Vasta-aineliuos 7 ml……………….……vihreä korkki
l Liuos A 7 ml…………………….….……valkoinen korkki
l Liuos B 7ml………………………………..punainen korkki
l Pysäytysliuos 7 ml.………………………….keltainen korkki
l 20× väkevä pesuliuos 40ml
……………………………………..…läpinäkyvä korkki
l 4 x väkevä uuttoliuos 50 ml
………………………………………………….sininen lippalakki
7. Reagenssien valmistus:
Ratkaisu 1:0,1 mol/l NaOH-liuosta
Punnitse 0,4 g NaOH 100 ml:aan deionisoitua vettä ja sekoita kokonaan.
Ratkaisu 2: 1 mol/l NaOH-liuos
Punnitse 4 g NaOH:a 100 ml:aan deionisoitua vettä ja sekoita kokonaan.
Ratkaisu 3: Karbonaattipuskurisuola
Ratkaisu1: 0,2M PB
Liuota 51,6 g Na:ta2HPO4· 12H2O, 8,7 g NaH:ta2PO4· 2H2O deionisoidulla vedellä ja laimenna 1000 ml:ksi.
Ratkaisu2: Uuttoliuos
Laimenna 2x väkevä uuttoliuos deionisoidulla vedellä tilavuussuhteessa 1:1 (esim. 10 ml 2x-uuttoliuosta + 10 ml deionisoitua vettä), jota käytetään näytteen erottamiseen,tätä liuosta voidaan säilyttää 4 ℃:ssa 1 kuukauden ajan.
Ratkaisu3: Pesuliuos
Laimenna 20-kertainen väkevä pesuliuos deionisoidulla vedellä tilavuussuhteessa 1:19 (esim. 5 ml 20x pesuliuosta + 95 ml deionisoitua vettä), jota käytetään lautasten pesuun.Tätä liuosta voidaan säilyttää 4 ℃:ssa 1 kuukauden ajan.
8. Näytteen valmistelu
8.1 Huomautus ja varotoimet ennen käyttöä:
(a) Käytä kokeessa yksittäisiä kärkiä ja vaihda kärjet, kun imee eri reagenssia.
(b) Varmista, että kaikki instrumentit ovat puhtaita.
(c) Säilytä kudosnäyte jäädytettynä.
(d) Valmistettu näyte tulee käyttää määritykseen heti.
8.2 Eläinkudos (kana, sianliha jne.)
----Homogenoi näyte homogenisaattorilla;
----Ota 2,0±0,05 g homogenaattia 50 ml:n polystyreenisentrifugiputkeen;lisää 2 ml 0,2 M PB (ratkaisu1), ravista liukenemaan, lisää sitten 8 ml etyyliasetaattia ja ravista voimakkaasti 3 minuuttia;
----Sentrifugi erotusta varten: 3000 g / ympäristön lämpötila / 5 min.
---- Siirrä 4 ml supernatanttia orgaanista faasia 10 ml:n lasiputkeen, kuivaa 50-60 ℃ vesihauteessa typpikaasuvirrassa;
----Liuota kuiva jäännös 1 ml:aan n-heksaania, vorteksoi 30 sekuntia, jotta se liukenee, ja lisää sitten 1 ml uuttoliuosta (ratkaisu2), pyöritä 1 minuutin ajan.sentrifugi erotusta varten: 3000 g / ympäristön lämpötila / 5 min
----Poista supernatantti n-heksaanifaasi;ota 50 μl substraatin vesifaasia määritystä varten.
Laimennuskerroin: 1
8.2 Maito
----Otetaan 100 μl raakamaidonäytettä, sekoitetaan 900 μl:aan uuttoliuosta (ratkaisu2) ja sekoita kokonaan.
----Ota 50 μl valmistettua liuosta määritystä varten.
Laimennuskerroin: 10
9. Määritysprosessi
9.1 Huomautus ennen määritystä
9.1.1Varmista, että kaikki reagenssit ja mikrokuopat ovat kaikki huoneenlämpöisiä (20-25 ℃).
9.1.2Palauta kaikki loput reagenssit arvoon 2-8℃heti käytön jälkeen.
9.1.3Mikrokuoppien oikea pesu on tärkeä vaihe määritysprosessissa;se on elintärkeä tekijä ELISA-analyysin uusittavuuden kannalta.
9.1.4 Atyhjennä valo ja peitä mikrokuopat inkubaation aikana.
9.2 Määritysvaiheet
9.2.1 Ota kaikki reagenssit pois huoneenlämmössä (20-25 ℃) yli 30 minuutin ajaksi, ravista kevyesti ennen käyttöä.
9.2.2 Ota tarvittavat mikrokuopat ulos ja palauta loput välittömästi vetoketjulliseen pussiin 2-8℃ lämpötilaan.
9.2.3 Laimennettu pesuliuos tulee lämmittää huoneenlämpöiseksi ennen käyttöä.
9.2.4Määrä:Numeroitu jokainen mikrokuoppapaikka ja kaikki standardit ja näytteet tulee ajaa kahtena kappaleena.Kirjaa muistiin standardit ja näytepaikat.
9.2.5Add standardiliuos/näyte ja vasta-aineliuos: Lisää 50 µl standardiliuosta((paketti mukana)) tai valmistettu näyte vastaaviin kuoppiin.Lisää 50 µl vasta-aineliuosta (paketti mukana).Sekoita varovasti ravistamalla levyä käsin ja inkuboi 30 minuuttia 37 ℃:ssa kannen kanssa.
9.2.6Pestä: Poista kansi varovasti ja puhdista neste pois kuopista ja huuhtele mikrokuopat 250 µl:lla laimennettua pesuliuosta (ratkaisu3) 10 sekunnin välein 4-5 kertaa.Imeytä jäännösvesi imukykyisellä paperilla (jäljellä oleva ilmakupla voidaan poistaa käyttämättömällä kärjellä).
9.2.7Lisää entsyymikonjugaatti: Lisää 100 ml entsyymikonjugaattiliuosta (paketti mukana) jokaiseen kuoppaan, sekoita varovasti ja inkuboi 30 minuuttia 37 ℃:ssa kannen kanssa.Toista pesuvaihe uudelleen.
9.2.8Väri: Lisää 50 µl liuosta A(paketti mukana) ja 50 µl liuosta B(paketti mukana) jokaiseen kaivoon.Sekoita varovasti ja inkuboi 15 minuuttia 37 ℃ kannen kanssa.
9.2.9Mitata: Lisää 50 µl pysäytysliuosta (paketti mukana) jokaiseen kaivoon.Sekoita varovasti ja mittaa absorbanssi aallonpituudella 450 nm (suositus on mitata kaksoisaallonpituudella 450/630 nm. Lue tulos 5 minuutin sisällä pysäytysliuoksen lisäämisen jälkeen).
10. Tulokset
10.1 Absorbanssin prosenttiosuus
Standardeille ja näytteille saatujen absorbanssiarvojen keskiarvot jaetaan ensimmäisen standardin absorbanssiarvolla (nollastandardi ) ja kerrotaan 100 %:lla.Nollastandardiksi tehdään näin ollen 100 % ja absorbanssiarvot ilmoitetaan prosentteina.
B
Absorbanssi (%) = —— × 100 %
B0
B - absorbanssistandardi (tai näyte)
B0 ——absorbanssin nollastandardi
10.2 Vakiokäyrä
----Vakiokäyrän piirtäminen: Otetaan standardien absorbanssiarvo y-akseliksi ja puolilogaritminen tylosiinistandardiliuoksen pitoisuudesta (ppb) x-akseliksi.
----Jokaisen näytteen tylosiinipitoisuus (ppb), joka voidaan lukea kalibrointikäyrästä, kerrotaan kunkin seurattavan näytteen vastaavalla laimennuskertoimella ja saadaan näytteen todellinen pitoisuus.
Huomaa:
Tietojen analysointiin on kehitetty erityinen ohjelmisto, joka voidaan toimittaa pyynnöstä.
11. Herkkyys, tarkkuus ja tarkkuus
Testin herkkyys:1,5 ppb
Tunnistusraja:
Eläinkudos…………………………………………1,5 ppb Maito……………………………………………………..15 ppb Tarkkuus:
Eläinkudos…………………………………………80±15 %
Maito…………………………………………………………80±10 %
Tarkkuus:
ELISA-sarjan variaatiokerroin on alle 10 %.
12. Huomaa
12.1 Standardeille ja näytteille saatujen absorbanssiarvojen keskiarvot pienenevät, jos reagensseja ja näytteitä ei ole säädetty huoneenlämpötilaan (20-25℃).
12.2 Älä anna mikrokuoppien kuivua vaiheiden välillä epäonnistuneen toistettavuuden välttämiseksi ja käytä seuraavaa vaihetta välittömästi mikrokuoppien pidikkeen napautuksen jälkeen.
12.3 Ravista kutakin reagenssia kevyesti ennen käyttöä.
12.4 Pidä ihosi poissa pysäytysliuoksesta, sillä se on 0,5MH2SO4ratkaisu.
12.5 Älä käytä vanhentuneita sarjoja.Älä vaihda eri erien reagensseja, muuten herkkyys laskee.
12.6 Säilytä ELISA-sarjat 2-8 ℃:ssa, älä jäädytä.Sulje mikrokuoppalevyt. Vältä suoraa auringonvaloa kaikkien inkubaatioiden aikana.Mikrotiitterilevyjen peittämistä suositellaan.
12.7 Alustaliuos tulee jättää käyttämättä, jos se värjäytyy.Reagenssit voivat muuttua huonoiksi, jos nollastandardin absorbanssiarvo (450/630 nm) on alle 0,5 (A450 nm < 0,5).
12.8 Väritysreaktio vaatii 15 minuuttia liuoksen A ja liuoksen B lisäämisen jälkeen. Voit myös pidentää inkubointiaikaa 20 minuuttiin tai pidemmäksi, jos väri on liian vaalea määritettäväksi.Älä koskaan ylitä 30 minuuttia, päinvastoin, lyhennä inkubaatioaikaa kunnolla.
12.9 Optimaalinen reaktiolämpötila on 37 ℃.Korkeampi tai matalampi lämpötila johtaa herkkyys- ja absorbanssiarvojen muutoksiin.
13. Varastointi
Säilytystila: 2-8℃.
Varastointiaika: 12 kuukautta.
