Samkeppnishæft ensímónæmisprófunarsett fyrir magngreiningu á týlósíni
Samkeppnishæft ensímónæmisprófunarsett fyrir
Magngreining áTylosin
1. Bakgrunnur
Tylosiner makrólíð sýklalyf, sem er aðallega notað sem bakteríudrepandi og and-mycoplasma.Strangar hámarksgildi leifa hafa verið staðfest þar sem þetta lyf getur leitt til alvarlegra aukaverkana hjá ákveðnum hópum.
Þetta sett er ný vara sem byggir á ELISA tækni, sem er hröð, auðveld, nákvæm og næm miðað við algenga tækjagreiningu og þarf aðeins 1,5 klst í einni aðgerð, það getur talsvert lágmarkað aðgerðavillur og vinnuálag.
2. Prófregla
Þetta sett er byggt á óbeinni samkeppnishæfri ELISA tækni.Örtítraholurnar eru húðaðar með tengingarmótefnavaka.Týlósínleifar í sýninu keppa við mótefnavakann sem er húðaður á örtítraplötunni um mótefnið.Eftir að ensímmerkt mótefni hefur verið bætt við er TMB hvarfefni notað til að sýna litinn.Frásog sýnisins er neikvætt tengt týlósíninu sem er í því, eftir að hafa borið saman við staðalferilinn, margfaldað með þynningarstuðlinum, er hægt að reikna út magn týlósínleifa í sýninu.
3. Umsóknir
Þetta sett er hægt að nota í megindlegri og eigindlegri greiningu á týlósínleifum í dýravef (kjúklingur, svínakjöt, önd) og mjólk, hunangi, eggi osfrv.
4. Víxlviðbrögð
Týlósín………………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………………<2%
5. Nauðsynlegt efni
5.1 Búnaður:
---- Microtiter plötu litrófsmælir (450nm/630nm)
---- Snúningsuppgufunartæki eða köfnunarefnisþurrkunartæki
---- einsleitari
----Histari
---- Miðflótta
---- Greiningarjafnvægi (inductance: 0,01g)
----Kráðpípetta: 10ml
----Gúmmípípettupera
----Rúmmálsflaska: 10ml
----Pólýstýren skilvindurör: 50ml
---- Örpípettur: 20-200ml, 100-1000ml
250ml margpípetta
5.2 Hvarfefni:
----Natríumhýdroxíð (NaOH, AR)
----Natríumbíkarbónat (NaHCO3,AR)
---- Natríumkarbónat (NaCO3, AR)
----Tríklórediksýra (AR)
---- Asetónítríl (AR)
---- Etýl asetat (AR)
┅┅n-hexan (AR)
---- Afjónað vatn
6. Kit Íhlutir
l Örtítraplata með 96 brunnum húðuð með mótefnavaka
l Staðlaðar lausnir (5 flöskur, 1 ml/flaska)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Stöðluð stýring: (1ml/flaska)1 ppm
l Ensímsamtenging 1ml……………..…..…rauð lok
l Mótefnalausn 7ml………………..……græn loki
l Lausn A 7ml………………………….….……hvítt lok
l Lausn B 7ml…………………………………………..rautt lok
l Stöðvunarlausn 7ml……………………………….gult lok
l 20×þétt þvottalausn 40ml
…………………………………..…gegnsætt lok
l 4×þétt útdráttarlausn 50ml
……………………………………………….blá hetta
7. Undirbúningur hvarfefna:
Lausn 1:0,1mól/L NaOH lausn
Vigtið 0,4g NaOH í 100ml afjónuðu vatni og blandið alveg saman.
Lausn 2: 1mól/L NaOH lausn
Vigtið 4g NaOH í 100ml afjónuðu vatni og blandið alveg saman.
Lausn 3: Carbonate buffer salt
Lausn1: 0,2M PB
Leysið 51,6 g af Na2HPO4·12H2O, 8,7 g af NaH2PO4·2H2O með afjónuðu vatni og þynnt í 1000ml.
Lausn2: Útdráttarlausn
Þynntu 2× óblandaða útdráttarlausnina með afjónuðu vatni í rúmmálshlutfallinu 1:1(td 10ml af 2×útdráttarlausn + 10ml af afjónuðu vatni), sem verður notað til sýnatöku,þessa lausn er hægt að geyma við 4 ℃ í 1 mánuð.
Lausn3: Þvottalausn
Þynntu 20× óblandaða þvottalausnina með afjónuðu vatni í rúmmálshlutfallinu 1:19(td 5ml af 20×þvottalausn + 95ml af afjónuðu vatni), sem verður notað til að þvo plöturnar.Þessa lausn er hægt að geyma við 4 ℃ í 1 mánuð.
8. Sýnaundirbúningur
8.1 Tilkynning og varúðarráðstafanir fyrir notkun:
(a) Vinsamlegast notaðu stakar ábendingar í tilraunaferlinu og breyttu oddunum þegar þú gleypir mismunandi hvarfefni.
(b) Gakktu úr skugga um að öll hljóðfæri séu hrein.
(c) Geymið vefjasýni í frystingu.
(d) Nota skal tilbúið sýni til greiningar strax.
8.2 Dýravefur (kjúklingur, svínakjöt osfrv.)
---- Einsleit sýnið með einsleitara;
----Takaðu 2,0±0,05g af einsleitu efni í 50ml pólýstýren skilvindurör;bætið við 2ml af 0,2M PB (lausn1), hristið til að leysast upp og bætið síðan við 8 ml af etýlasetati og hristið grimmt í 3 mín;
---- Miðflótta fyrir aðskilnað: 3000g / umhverfishitastig / 5 mín.
----Flyttu 4ml af lífrænum fasa flotans í 10ml glerrör, þurrkaðu með 50-60 ℃ vatnsbaði undir köfnunarefnisgasstraumi;
----Leysið þurra afganginn upp með 1ml af n-hexani, hringið í 30 sekúndur til að leysast upp og bætið síðan við 1ml af útdráttarlausn (lausn2), hringið í 1 mín.skilvindu fyrir aðskilnað: 3000g / umhverfishiti / 5mín
----Fjarlægðu n-hexanfasa flotans;taktu 50μl af vatnsfasa undirlagsins til greiningar.
Þynningarstuðull: 1
8.2 Mjólk
----Taka 100μl af hrámjólkursýni, blanda saman við 900μl af útdráttarlausn (lausn2), og blandið alveg saman.
----Takið 50μl af tilbúnu lausninni til greiningar.
Þynningarstuðull: 10
9. Prófunarferli
9.1 Tilkynning fyrir prófun
9.1.1Gakktu úr skugga um að öll hvarfefni og örholur séu allir við stofuhita (20-25 ℃).
9.1.2Settu öll rest hvarfefnin aftur í 2-8℃strax eftir notkun.
9.1.3Að þvo örholurnar rétt er mikilvægt skref í prófunarferlinu;það er mikilvægur þáttur í endurgerðanleika ELISA greiningarinnar.
9.1.4 Atóma ljósið og hylja örholurnar meðan á ræktun stendur.
9.2 Greiningarskref
9.2.1 Takið öll hvarfefni út við stofuhita (20-25 ℃) í meira en 30 mínútur, hristið varlega fyrir notkun.
9.2.2 Fáðu örholurnar sem þarf út og skilaðu afganginum strax í renniláspokann við 2-8 ℃.
9.2.3 Þynntu þvottalausnina á að hita aftur þannig að hún sé við stofuhita fyrir notkun.
9.2.4Númer:Númeraðar allar örbrunnur og allir staðlar og sýni ættu að vera keyrð í tvíriti.Skráðu staðla og sýnishorn.
9.2.5Add staðallausn/sýni og mótefnalausn: Bætið við 50µl af staðallausn ((setti fylgir)) eða undirbúið sýni í samsvarandi brunna.Bætið við 50µl af mótefnalausn (setti fylgir).Blandið varlega með því að hrista plötuna handvirkt og ræktið í 30 mínútur við 37 ℃ með loki.
9.2.6Þvo: Fjarlægðu hlífina varlega og hreinsaðu vökvann úr brunnunum og skolaðu örholurnar með 250µl þynntri þvottalausn (lausn3) með 10 sekúndum millibili í 4-5 skipti.Gleypið afgangsvatnið með ísogandi pappír (hægt er að fjarlægja loftbóluna sem eftir er með ónotuðum odd).
9.2.7Bæta við ensímsamtengingu: Bætið við 100ml af ensímsamtengingarlausn(setti fylgir) í hvern brunn, blandið varlega saman og ræktið í 30 mínútur við 37 ℃ með loki.Endurtaktu þvottaskrefið aftur.
9.2.8Litun: Bætið við 50µl af lausn A(setti fylgir) og 50µl af lausn B(setti fylgir) við hvern brunn.Blandið varlega saman og ræktið í 15 mínútur við 37 ℃ með loki.
9.2.9Mæla: Bætið við 50µl af stöðvunarlausninni(setti fylgir) við hvern brunn.Blandið varlega saman og mælið gleypni við 450nm (mælt er með tvíbylgjulengdinni 450/630nm. Lesið niðurstöðuna innan 5 mín eftir að stöðvunarlausn er bætt við).
10. Úrslit
10.1 Hlutfallsgleypni
Meðalgildum gleypnigildanna sem fæst fyrir staðlana og sýnin er deilt með gleypnigildi fyrsta staðalsins (núllstaðall ) og margfaldað með 100%.Núllstaðallinn er þannig gerður jafn 100% og gleypnigildin eru gefin upp í prósentum.
B
Frásog (%) = —— ×100%
B0
B ——gleypnistaðall (eða sýni)
B0 ——gleypni núll staðall
10.2 Standard Curve
----Til að teikna staðlaðan feril: Taktu gleypnigildi staðla sem y-ás, hálf lógaritmísk styrkur týlósínstaðlalausnarinnar (ppb) sem x-ás.
----Týlósínstyrkur hvers sýnis (ppb), sem hægt er að lesa úr kvörðunarferlinu, er margfaldaður með samsvarandi þynningarstuðli hvers sýnis sem fylgt er eftir og raunverulegur styrkur sýnis er fenginn.
Vinsamlegast athugið:
Sérstakur hugbúnaður hefur verið þróaður fyrir gagnagreiningu sem hægt er að útvega sé þess óskað.
11. Næmi, nákvæmni og nákvæmni
Prófnæmi:1,5 ppb
Greiningarmörk:
Dýravefur……………………………….…………………1.5ppb Mjólk…………………………………………………………………..15ppb Nákvæmni:
Dýravefur………………………………………………80±15%
Mjólk…………………………………………..……….……80±10%
Nákvæmni:
Breytileikastuðull ELISA settsins er minni en 10%.
12. Tilkynning
12.1 Meðalgildi gleypnigildanna sem fást fyrir staðla og sýni munu lækka ef hvarfefnin og sýnin hafa ekki verið stillt í stofuhita (20-25 ℃).
12.2 Ekki leyfa örholum að þorna á milli þrepa til að koma í veg fyrir árangurslausa endurgerð og notaðu næsta skref strax eftir að hafa bankað á örholuhaldarann.
12.3 Hristið hvert hvarfefni varlega fyrir notkun.
12.4 Haltu húðinni frá stöðvunarlausninni því hún er 0,5MH2SO4lausn.
12.5 Ekki nota pökkin úrelt.Ekki skipta um hvarfefni mismunandi lotum, annars mun það minnka næmni.
12.6 Geymið ELISA-settin við 2-8 ℃, má ekki frjósa.Innsiglið hvíldar örbrunnsplötur, Forðist beint sólarljós meðan á ræktun stendur.Mælt er með því að hylja míkrótíterplöturnar.
12.7 Yfirgefa ætti undirlagslausn ef hún tekur lit.Hvarfefnin geta orðið slæm ef gleypnigildi (450/630nm) núllstaðalsins er minna en 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Litunarhvarfið þarf 15 mínútur eftir að lausn A og lausn B hefur verið bætt við. Og þú getur lengt ræktunartímana í 20 mínútur eða lengur ef liturinn er of ljós til að hægt sé að ákvarða.Aldrei fara yfir 30 mín, þvert á móti, stytta ræktunartímann rétt.
12.9 Ákjósanlegur hvarfhiti er 37 ℃.Hærra eða lægra hitastig mun leiða til breytinga á næmi og gleypnigildum.
13. Geymsla
Geymsluástand: 2-8 ℃.
Geymslutími: 12 mánuðir.
