vokatra

1. Lafo

Tylosindia antibiotika macrolide, izay ampiasaina indrindra ho antibacterial sy anti-mycoplasma.MRLs henjana dia napetraka satria io fanafody io dia mety hiteraka voka-dratsy lehibe amin'ny vondrona sasany.

Ity kitapo ity dia vokatra vaovao mifototra amin'ny teknolojia ELISA, izay haingana, mora, marina ary saro-pady raha ampitahaina amin'ny famakafakana fitaovana mahazatra ary mila ora 1.5 ao anatin'ny fandidiana iray ihany, afaka manamaivana be ny fahadisoana sy ny hamafin'ny asa.

2. Fitsipika fitsapana

Ity kitapo ity dia mifototra amin'ny teknolojia ELISA tsy mivantana.Ny lava-drano microtiter dia rakotra antigène mifamatotra.Ny sisa tavela amin'ny tylosin ao amin'ny santionany dia mifaninana amin'ny antigène mifono eo amin'ny takelaka microtiter ho an'ny antibody.Aorian'ny fampidirana anzima misy marika anti-antibody, ny substrate TMB dia ampiasaina hanehoana ny loko.Ny tsy fahampian'ny santionany dia misy ifandraisany amin'ny tylosina mipetraka ao, rehefa ampitahaina amin'ny Standard Curve, ampitomboina amin'ny fandotoana, dia azo kajy ny habetsahan'ny sisa tavela amin'ny santionany.

3. Fampiharana

Ity kitapo ity dia azo ampiasaina amin'ny famakafakana quantitative sy qualitative ny sisa tavela amin'ny tylosin amin'ny tavy biby (akoho, kisoa, gana) sy ronono, tantely, atody, sns.

4. Fihetseham-po

Tylosin ……………………………………………..100%

Tilmicosin…………………………………………<2%

5. Fitaovana ilaina

5.1 Fitaovana:

----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)

----Evaporator rotary na fitaovana fanamainana azota

----homogenizer

----Shaker

----Centrifuge

----Mandanjalanja analytique (inductance: 0.01g)

----Pipette nahazo diplaoma: 10ml

----Fingotra pipette takamoa

---- Tavoahangy voly: 10ml

----Polystyrene centrifuge fantsona: 50ml

----Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml

250ml-multipipette

5.2 Reagents:

----Sodium hydroxide (NaOH, AR)

----Sodium bikarbonate (NaHCO_3,AR)

---- Sodium carbonate (NaCO₃, AR)

----Asidra trichloroacetic (AR)

---- Acetonitrile (AR)

----Ethyl acetate (AR)

┅┅n-Hexane (AR)

----Rano deionized

6. Kit singa

l takelaka Microtiter misy lavaka fantsakana 96 misy antigène

L vahaolana mahazatra (5 tavoahangy, 1ml / tavoahangy)

0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb

L Spiking fitsipika fanaraha-maso: (1ml/tavoahangy)1ppm

l Enzyme conjugate 1ml……………………………karatra mena

l Vahaolana antibody 7ml……………………………………

l Vahaolana A 7ml………………………………..satroka fotsy

l Vahaolana B 7ml...................................................

l Atsaharo ny vahaolana 7ml.…………………………………….satroka mavo

l 20 × vahaolana fanasan-damba 40ml

…………………………………..satrony mangarahara

l 4 × vahaolana fitrandrahana 50ml

…………………………………………….satroka manga

7. Fiomanana Reagents:

Vahaolana 1:0.1mol/L NaOH vahaolana

Mandanja 0,4g NaOH hatramin'ny 100ml rano deionized ary afangaro tanteraka.

Vahaolana 2: Vahaolana 1mol/L NaOH

Lanjany 4g NaOH hatramin'ny 100ml rano deionized ary afangaro tanteraka.

Vahaolana 3: Sira asiana karibonetra

vahaolana1: 0,2M PB

Atsaharo ny 51,6 g ny Na₂HPO₄· 12H₂O, 8,7 g ny NaH₂PO₄·2H₂O amin'ny rano deionized ary dilute ho 1000ml.

vahaolana2: Vahaolana fitrandrahana

Esory ny vahaolana fitrandrahana 2 × mivondrona miaraka amin'ny rano deionized amin'ny tahan'ny volume 1: 1 (oh 10ml 2×extraction solution + 10ml deionized water), izay ampiasaina amin'ny fitrandrahana santionany,ity vahaolana ity dia azo tehirizina amin'ny 4 ℃ mandritra ny 1 volana.

vahaolana3: Vahaolana sasana

Esory ny 20 × vahaolana fanasan-damba amin'ny rano deionized amin'ny tahan'ny 1:19 (oh 5ml 20×wash solution + 95ml deionized rano), izay hampiasaina hanasana ny lovia.Ity vahaolana ity dia azo tehirizina amin'ny 4 ℃ mandritra ny 1 volana.

8. Fanomanana santionany

8.1 Fampandrenesana sy fitandremana alohan'ny fandidiana:

(a) Azafady, ampiasao toro-hevitra tokana amin'ny dingan'ny fanandramana, ary ovay ny toro-hevitra rehefa misintona reagent samihafa.

b) Ataovy azo antoka fa madio avokoa ny fitaovana rehetra.

(c) Tazony ao anaty vata mangatsiaka ny santionany.

(d) Ny santionany voaomana dia tokony hampiasaina amin'ny fitiliana indray mandeha.

8.2 Tavy biby (akoho, kisoa, sns)

----Atao homogenize ny santionany amin'ny homogenizer;

---- Raiso 2.0 ± 0.05g ny homogenate ao anaty tavoahangy polystyrene centrifuge 50ml;ampio 2ml amin'ny 0.2M PB (vahaolana1) , mihozongozona mba ho levona, ary avy eo ampio 8ml ethyl acetate ary kobanina mafy mandritra ny 3 minitra;

----Centrifuge ho an'ny fisarahana: 3000g / ambient mari-pana / 5min.

---- Transfer 4ml ny supernatant organika dingana ho 10ml fitaratra fantsona, maina amin'ny 50-60 ℃ rano fandroana ambanin'ny azota entona renirano;

----Alefaso miaraka amin'ny 1ml n-hexane ny sisa maina, vortex mandritra ny 30s mba levona, ary ampio 1ml ny vahaolana fitrandrahana (vahaolana2), vortex mandritra ny 1 min.centrifuge ho fisarahana: 3000g / ambient mari-pana / 5min

----Esory ny dingana supernatant n-hexane;maka 50μl ny substrate aqueous dingana ho fitiliana.

Fatorana dilution: 1

8.2 Ronono

----Makà santionany ronono manta 100μl, afangaro amin'ny vahaolana fitrandrahana 900μl (vahaolana2), ary afangaro tanteraka.

---- Makà 50μl ny vahaolana voaomana hanaovana fitiliana.

Fandotoana: 10

9. Fomba fitiliana

9.1 Fanamarihana alohan'ny fitiliana

9.1.1Ataovy azo antoka fa ny reagents sy microwells rehetra dia ao amin'ny mari-pana (20-25 ℃).

9.1.2Avereno amin'ny 2-8 ny reagents sisa rehetra℃avy hatrany rehefa ampiasaina.

9.1.3Dingana lehibe amin'ny dingan'ny fitiliana ny fanasana tsara ny microwells;Izany no antony lehibe amin'ny famerenana indray ny fanadihadiana ELISA.

9.1.4 Aesory ny hazavana ary manarona ny microwells mandritra ny incubation.

9.2 Dingana Fanamarinana

9.2.1 Esory ny reagents rehetra amin'ny mari-pana (20-25 ℃) mandritra ny 30 minitra mahery, ahetsiketsika moramora alohan'ny hampiasana azy.

9.2.2 Esory ny microwells ilaina ary avereno any amin'ny kitapo zip-hidy amin'ny 2-8 ℃ avy hatrany ny ambiny.

9.2.3 Ny vahaolana fanasan-damba efa voalefona dia tokony havaozina mba ho amin'ny mari-pana alohan'ny hampiasana azy.

9.2.4laharana:Ny toeran'ny microwell rehetra ary ny fenitra sy ny santionany rehetra dia tokony atao dika mitovy.Raketo ny toerana misy ny fenitra sy ny santionany.

9.2.5Add vahaolana / santionany ary vahaolana antibody: Ampio 50µl ny vahaolana mahazatra((kitapo nomena)) na santionany voaomana amin'ny lavadrano mifanandrify.Ampio 50µl ny antibody solution (kitapo nomena).Afangaro moramora amin'ny alalan'ny fanozongozonana ny lovia amin'ny tanana ary atsofohy mandritra ny 30 minitra amin'ny 37 ℃ miaraka amin'ny fonony.

9.2.6sasao madio: Esory moramora ny fonony ary diovy ny ranon-javatra mivoaka avy ao amin'ny lavadrano ary kobanina amin'ny 250µl vahaolana fanasan-damba ny microwell (vahaolana3) amin'ny elanelana 10s ho an'ny in-4-5.Atsofohy amin'ny taratasy misoroka ny rano sisa tavela (azo esorina amin'ny tendrony tsy ampiasaina ny bubble rivotra sisa).

9.2.7Ampio conjugate anzima: Ampio 100ml ny enzyme conjugate solution(kitapo nomena) isaky ny fantsakana, afangaro moramora ary atsipazo mandritra ny 30min amin'ny 37 ℃ miaraka amin'ny fonony.Avereno indray ny dingana fanasana.

9.2.8Fandokoana: Ampio 50µl ny vahaolana A(kitapo nomena) ary 50µl ny vahaolana B (kitapo nomena) amin’ny lavadrano tsirairay.Afangaroy moramora ary atsipazo mandritra ny 15min amin'ny 37 ℃ miaraka amin'ny fonony.

9.2.9ohatra: Ampio 50µl ny vahaolana fijanonana (kitapo nomena) amin’ny lavadrano tsirairay.Afangaro moramora ary refesina amin'ny 450nm ny fandrefesana ny fisondrotry ny rano (Torohevitra ny fandrefesana amin'ny halavan'ny onjam-droa 450/630nm. Vakio ny valiny ao anatin'ny 5min aorian'ny fampidirana vahaolana mijanona).

10. Vokatra

10.1 Isan-jato ny fandraisana

Ny sandan'ny sandan'ny sandan'ny absorbance azo ho an'ny fenitra sy ny santionany dia zaraina amin'ny sandan'ny absorbance amin'ny fenitra voalohany (standard zero) ary ampitomboina amin'ny 100%.Ny fenitra aotra dia atao mitovy amin'ny 100% ary ny soatoavin'ny absorbance dia voatonona amin'ny isan-jato.

B

Fisorohana (%) = —— ×100%

B0

B ——manara-penitra (na santionany)

B0 ——absorbance zero standard

10.2 Curve mahazatra

----Mba hanao filaharana manara-penitra: Raiso ho axis y ny sandan'ny faneriterena amin'ny fenitra, semi-logarithmika amin'ny fifantohan'ny vahaolana fenitra tylosin (ppb) ho x-axis.

----Ny fifantohan'ny tylosina isaky ny santionany (ppb), izay azo vakiana avy amin'ny curve calibration, dia ampitomboina amin'ny fandotoana mifanandrify amin'ny santionany tsirairay arahina, ary azo ny tena fifantohan'ny santionany.

Mariho azafady:

software manokana dia novolavolaina ho an'ny fanadihadiana angona, izay azo omena amin'ny fangatahana.

11. Fahatsapana, fahitsiana ary mazava tsara

Fitsapana fahatsapana:1.5ppb

fetra hita maso:

Tavin-biby……………………………………………………1.5ppb Ronono ………………………………………………………..15ppb Fahamarinana:

Tavin-biby…………………………………………80±15%

Ronono ……………………………………………………… 80±10%

Precision:

Ny tahan'ny fiovaovan'ny kitapo ELISA dia latsaky ny 10%.

12. Mariho

12.1 Ny sandan'ny sandan'ny absorbance azo amin'ny fenitra sy ny santionany dia hihena raha toa ka tsy voafehy amin'ny mari-pana (20-25 ℃) ny reagents sy ny santionany.

12.2 Aza avela ho maina eo anelanelan'ny dingana ny microwells mba hialana amin'ny tsy fahombiazan'ny famokarana ary mandehana ny dingana manaraka avy hatrany aorian'ny fikapohana ny fitoeran'ny microwell.

12.3 Ahozongozona moramora ny reagent tsirairay alohan'ny hampiasana azy.

12.4 Arovy ny hoditrao amin'ny vahaolana mijanona fa 0.5MH izy io₂SO₄vahaolana.

12.5 Aza mampiasa ny kitapo efa lany andro.Aza mifanakalo ny reagents amin'ny andiany samihafa, fa raha tsy izany dia hampidina ny fahatsapana izany.

12.6 Tazony amin'ny 2-8 ℃ ny kitapo ELISA, aza mivaingana.Asio tombo-kase ny takelaka microwell, Fadio ny tara-masoandro mivantana mandritra ny incubation rehetra.Ny fandrakofana ny takelaka microtiter dia soso-kevitra.

12.7 Ny vahaolana amin'ny substrate dia tokony hajanona raha miova loko.Mety ho ratsy ny reagents raha latsaky ny 0.5 (A450nm <0.5) ny sandan'ny absorbance (450/630nm) amin'ny fenitra aotra.

12.8 Ny fanehoan-kevitry ny loko dia mila 15min aorian'ny fanampiana ny vahaolana A sy ny vahaolana B. Ary azonao atao ny manitatra ny fe-potoana incubation hatramin'ny 20min na mihoatra raha maivana loatra ny lokony.Aza mihoatra ny 30min, mifanohitra amin'izany, hafohy tsara ny fotoana incubation.

12.9 Ny mari-pana fanehoan-kevitra tsara indrindra dia 37 ℃.Ny mari-pana ambony na ambany kokoa dia hitarika amin'ny fiovan'ny soatoavin'ny fahatsapan-tena sy ny assorance.

13. Fitehirizana

Toe-javatra fitahirizana: 2-8 ℃.

Fe-potoana fitahirizana: 12 volana.