タイロシン定量分析用競合酵素免疫測定キット
競合酵素免疫測定キット
の定量分析タイロシン
1. 背景
タイロシン主に抗菌および抗マイコプラズマとして適用されるマクロライド系抗生物質です。この薬は特定のグループで深刻な副作用を引き起こす可能性があるため、厳格な MRL が確立されています。
このキットは ELISA 技術に基づく新製品であり、一般的な機器分析と比較して、迅速、簡単、正確、高感度であり、1 回の操作で 1.5 時間しか必要とせず、操作エラーと作業強度を大幅に最小限に抑えることができます。
2. 試験原理
このキットは、間接競合 ELISA 技術に基づいています。マイクロタイターウェルは結合抗原でコーティングされています。サンプル中のタイロシン残基は、抗体を求めてマイクロタイター プレートにコーティングされた抗原と競合します。酵素標識抗抗体を添加した後、TMB基質を使用して色を表示します。サンプルの吸光度は、その中に存在するタイロシンと負の関係にあり、標準曲線と比較した後、希釈係数を掛けて、サンプル中のタイロシン残留量を計算できます。
3. アプリケーション
このキットは、動物組織（鶏肉、豚肉、鴨肉）および牛乳、蜂蜜、卵などに残留するタイロシンの定量および定性分析に使用できます。
4.交差反応
タイロシン………………………………………………..100%
チルミコシン………………………………………………<2%
5. 必要な資料
5.1 設備:
----マイクロタイタープレート分光光度計 (450nm/630nm)
----ロータリーエバポレーターまたは窒素乾燥器具
----ホモジナイザー
- - シェーカー
- - 遠心
----分析天秤（インダクタンス：0.01g）
----目盛り付きピペット：10ml
----ラバーピペットバルブ
----メスフラスコ：10ml
----ポリスチレン遠沈管：50ml
----マイクロピペット: 20-200ml、100-1000ml
250mlマルチピペット
5.2 試薬:
----水酸化ナトリウム (NaOH、AR)
----重炭酸ナトリウム (NaHCO3,AR)
---- 炭酸ナトリウム (NaCO3、AR)
----トリクロロ酢酸 (AR)
---- アセトニトリル (AR)
----酢酸エチル（AR）
┅┅n-ヘキサン (AR)
- - 脱イオン水
6. キットのコンポーネント
l 抗原でコーティングされた 96 ウェルのマイクロタイタープレート
l 標準液（5本、1ml/本）
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb
l スパイク標準コントロール: (1ml/ボトル)1ppm
l 酵素複合体 1ml………………..……..…赤キャップ
l 抗体溶液 7ml…………………………緑キャップ
l Solution A 7ml…………………….…….……白キャップ
l Solution B 7ml………………………………..赤キャップ
l Stop solution 7ml.……………….……….黄色のキャップ
l 20×濃縮洗浄液 40ml
…………………………………..…透明キャップ
l 4×濃縮抽出液 50ml
……………………………………………….ブルーキャップ
7. 試薬の準備:
解決策 1:0.1mol/L NaOH溶液
0.4g NaOH を 100ml の脱イオン水に量り、完全に混合します。
解決策 2：1mol/L NaOH溶液
4g NaOH を 100ml の脱イオン水に量り、完全に混ぜます。
解決策 3：炭酸緩衝塩
解決1: 0.2M PB
51.6gのNaを溶かす2HPO4・12H2O、8.7gのNaH2PO4・2H2脱イオン水で O を希釈し、1000ml に希釈します。
解決2: 抽出液
2倍濃縮抽出液を脱イオン水で体積比1:1に希釈(例：2×抽出液10ml＋脱イオン水10ml)、サンプル抽出に使用されます。この溶液は4℃で1ヶ月保存できます.
解決3: 洗浄液
20倍濃縮洗浄液を脱イオン水で体積比1:19(例：5mlの20×洗浄液+95mlの脱イオン水)、プレートを洗浄するために使用されます。この溶液は4℃で1ヶ月保存可能です.
8. サンプルの準備
8.1 操作前の通知と注意事項:
(a) 実験の過程で 1 回限りのチップを使用し、異なる試薬を吸収する場合はチップを交換してください。
(b) すべての器具がきれいであることを確認します。
(c) 組織サンプルを凍結保存します。
(d) 調製したサンプルは、すぐにアッセイに使用する必要があります。
8.2 動物の組織（鶏肉、豚肉など）
----ホモジナイザーでサンプルをホモジナイズします。
----2.0±0.05g のホモジネートを 50ml のポリスチレン遠心管に入れる。0.2M PB を 2ml 加えます (解決1) 振とうして溶かし、酢酸エチル 8ml を加えて 3 分間激しく振とうする。
----分離用遠心機：3000g/常温/5分
----上澄みの有機相 4ml を 10ml のガラス管に移し、窒素気流下で 50～60℃の水浴で乾燥させる。
----乾燥した残り物を1mlのn-ヘキサンで溶解し、30秒間ボルテックスして溶解し、1mlの抽出溶液を加えます(解決2)、1 分間ボルテックスします。分離用遠心機: 3000g / 周囲温度 / 5min
----上澄みの n-ヘキサン相を取り除きます。アッセイのために基質水相50μlを取る。
希釈倍率：1
8.2 牛乳
----生乳サンプル 100μl を採取し、抽出液 900μl と混合する (解決2)、完全に混ぜ合わせる。
----アッセイ用に調製した溶液を50μl採取します。
希釈倍率: 10
9. アッセイ プロセス
9.1 アッセイ前の注意事項
9.1.1すべての試薬とマイクロウェルがすべて室温 (20 ～ 25℃) であることを確認してください。
9.1.2残りの試薬をすべて 2-8 に戻します℃使用直後。
9.1.3マイクロウェルを正しく洗浄することは、アッセイのプロセスにおける重要なステップです。これは、ELISA 分析の再現性にとって重要な要素です。
9.1.4 A光を無効にし、インキュベーション中にマイクロウェルをカバーします。
9.2 アッセイ手順
9.2.1 すべての試薬を室温 (20 ～ 25℃) で 30 分以上取り出し、使用前に軽く振ってください。
9.2.2 必要なマイクロウェルを取り出し、残りを 2 ～ 8℃のジップロックバッグにすぐに戻します。
9.2.3 希釈した洗浄溶液は、使用前に室温に戻す必要があります。
9.2.4番号：すべてのマイクロウェル位置に番号を付け、すべての標準とサンプルを重複して実行する必要があります。標準とサンプルの位置を記録します。
9.2.5Add 標準溶液/サンプルおよび抗体溶液：標準液50μlを加える((キット提供)) または準備されたサンプルを対応するウェルに移します。50μlの抗体溶液を加えます(キット提供）。プレートを手で軽く振って混合し、蓋をして 37℃で 30 分間インキュベートします。
9.2.6洗う: カバーを静かに取り外し、ウェルから液体を取り除き、250µl の希釈洗浄液でマイクロウェルをすすぎます (解決3) 10 秒間隔で 4 ～ 5 回。吸収紙で残りの水を吸収します (残りの気泡は未使用のチップで除去できます)。
9.2.7酵素コンジュゲートを追加: 酵素複合体溶液100mlを加える(キット提供) を各ウェルに加え、静かに混合し、カバーをして 37℃で 30 分間インキュベートします。もう一度洗浄ステップを繰り返します.
9.2.8着色：溶液Aを50μl加える(キット提供) および 50µl の溶液 B(キット提供) 各ウェルに。穏やかに混合し、37℃で 15 分間、カバーをかけてインキュベートします。
9.2.9測定: 停止液を50μl加えます(キット提供) 各ウェルに。穏やかに混合し、450nm で吸光度を測定します (450/630nm の 2 波長で測定することをお勧めします。停止液を加えてから 5 分以内に結果を読み取ります)。
10. 結果
10.1 パーセンテージ吸光度
標準およびサンプルについて得られた吸光度値の平均値を、最初の標準 (ゼロ標準) の吸光度値で割り、100% を掛けます。したがって、ゼロ標準は 100% に等しくなり、吸光度の値はパーセンテージで示されます。
B
吸光度 (%) = —— ×100%
B0
B —— 吸光度標準 (またはサンプル)
B0 ——吸光度ゼロ標準
10.2 標準曲線
----検量線の作成: Y 軸に標準の吸光度値、X 軸にタイロシン標準溶液の濃度 (ppb) の片対数をとります。
----検量線から読み取れる各サンプルのタイロシン濃度 (ppb) に、対応する各サンプルの希釈係数を乗じて、サンプルの実際の濃度を求めます。
注意してください:
データ分析用に特別なソフトウェアが開発されており、ご要望に応じて提供することができます。
11. 感度、精度、精度
テスト感度:1.5ppb
検出限界:
動物組織………………………….……………1.5ppb 牛乳……………………………………………………..15ppb 正確さ：
動物組織……………………………………80±15%
牛乳………………………………………………80±10%
精度：
ELISAキットの変動係数は10%未満です。
12. 通知
12.1 試薬およびサンプルが室温 (20 ～ 25℃) に調整されていない場合、標準およびサンプルについて得られた吸光度値の平均値は減少します。
12.2 ステップ間でマイクロウェルを乾燥させないでください。再現性が損なわれるのを防ぎ、マイクロウェル ホルダーをタップした直後に次のステップを操作してください。
12.3 使用前に各試薬を軽く振ってください。
12.4 停止液は 0.5MH であるため、肌に近づけないでください2SO4解決。
12.5 期限切れのキットを使用しないでください。異なるバッチの試薬を交換しないでください。感度が低下します。
12.6 ELISA キットは 2～8℃で保管し、凍結させないでください。残りのマイクロウェル プレートをシールします。すべてのインキュベーション中、直射日光を避けてください。マイクロタイター プレートをカバーすることをお勧めします。
12.7 基質溶液が変色した場合は、廃棄する必要があります。ゼロスタンダードの吸光度値 (450/630nm) が 0.5 未満 (A450nm<0.5) の場合、試薬が劣化している可能性があります。
12.8 発色反応は A 液と B 液を加えてから 15 分程度必要です。発色が薄い場合は 20 分以上延長しても構いません。逆に、インキュベーション時間を適切に短縮してください。
12.9 至適反応温度は37℃です。温度が高いまたは低いと、感度と吸光度の値が変化します。
13.保管
保管条件：2～8℃。
保管期間：12ヶ月.
