طقم المقايسة المناعية الإنزيمية التنافسية للتحليل الكمي للتيلوزين
طقم المقايسة المناعية الإنزيمية التنافسية لـ
التحليل الكمي لـتايلوزين
1. الخلفية
تايلوزينهو مضاد حيوي لماكرولايد ، يستخدم بشكل أساسي كمضاد للبكتيريا ومضاد للميكوبلازما.تم إنشاء MRLs صارمة لأن هذا الدواء قد يؤدي إلى آثار جانبية خطيرة في مجموعات معينة.
هذه المجموعة عبارة عن منتج جديد يعتمد على تقنية ELISA ، وهي سريعة وسهلة ودقيقة وحساسة مقارنة بالتحليل الآلي الشائع وتحتاج فقط إلى 1.5 ساعة في عملية واحدة ، ويمكنها تقليل خطأ التشغيل وكثافة العمل بشكل كبير.
2. مبدأ الاختبار
تعتمد هذه المجموعة على تقنية ELISA التنافسية غير المباشرة.يتم تغطية آبار ميكروترتير مع مستضد اقتران.تتنافس بقايا Tylosin في العينة مع المستضد المطلي على لوحة microtiter للجسم المضاد.بعد إضافة الإنزيم المسمى بالجسم المضاد ، يتم استخدام ركيزة TMB لإظهار اللون.يرتبط امتصاص العينة سلبًا بمادة التيلوزين الموجودة فيها ، بعد المقارنة مع المنحنى القياسي ، مضروبًا في عامل التخفيف ، يمكن حساب كمية بقايا التيلوزين في العينة.
3. التطبيقات
يمكن استخدام هذه المجموعة في التحليل الكمي والنوعي لبقايا التيلوزين في الأنسجة الحيوانية (الدجاج ولحم الخنزير والبط) والحليب والعسل والبيض ، إلخ.
4. ردود الفعل المتصالبة
تايلوزين ………………………………………………… .. 100٪
التيلميكوزين ……………………………………………………………………………؛ 2٪
5. المواد المطلوبة
5.1 المعدات:
---- مقياس الطيف الضوئي ذو الألواح الدقيقة (450 نانومتر / 630 نانومتر)
---- مبخر دوار أو أدوات تجفيف النيتروجين
---- الخالطون
---- شاكر
----جهاز الطرد المركزي
---- ميزان تحليلي (الحث: 0.01 جرام)
---- ماصة متدرجة: 10 مللي
---- لمبة ماصة مطاطية
---- دورق حجمي: 10 مللي
---- أنابيب الطرد المركزي البوليسترين: 50 مل
---- الماصات الدقيقة: 20-200 مللي ، 100-1000 مللي
250 مل متعدد الماصة
5.2 الكواشف:
----هيدروكسيد الصوديوم (NaOH ، AR)
---- بيكربونات الصوديوم (NaHCO3,AR)
---- كربونات الصوديوم (NaCO3، AR)
---- حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (AR)
---- الاسيتونتريل (AR)
---- خلات الإيثيل (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----الماء منزوع الأيونات
6. مكونات المجموعة
ل صفيحة ميكروترية مع 96 بئراً مغلفة بمستضد
ل الحلول القياسية (5 زجاجات ، 1 مل / زجاجة)
0ppb ، 0.5ppb ، 1.5ppb ، 4.5ppb ، 13.5ppb
ل التحكم القياسي الشد: (1 مللي / زجاجة)1 جزء في المليون
ل إنزيم متقارن 1 مل …………… ..… ..… غطاء أحمر
ل.محلول الجسم المضاد 7 مل .................. ... الغطاء الأخضر
ل محلول أ 7 مل ............................. ...... قبعة بيضاء
ل محلول ب 7 مل ...................................... غطاء أحمر
ل وقف الحل 7 مل .................. قبعة صفراء
ل 20 × محلول غسيل مركز 40 مل
………………………………… ..… غطاء شفاف
ل 4 × محلول استخلاص مركز 50 مل
……………………………………………….كاب أزرق
7. تحضير الكواشف:
الحل 1:0.1 مول / لتر محلول هيدروكسيد الصوديوم
وزن 0.4 جرام هيدروكسيد الصوديوم إلى 100 مل ماء منزوع الأيونات ويخلط تماما.
الحل 2: 1 مول / لتر محلول هيدروكسيد الصوديوم
تزن 4 جرام هيدروكسيد الصوديوم إلى 100 مل ماء منزوع الأيونات ويخلط تمامًا.
الحل 3: ملح كربوناتي منظم
المحلول1: 0.2 ميجا بايت PB
قم بإذابة 51.6 جم من Na2HPO4· 12 ح2O ، 8.7 جرام من NaH2PO4· 2 ح2يا مع الماء منزوع الأيونات ويخفف حتى 1000 مل.
المحلول2: محلول الاستخراج
خفف محلول الاستخراج المركز 2 × بالماء منزوع الأيونات بنسبة حجم 1: 1 (على سبيل المثال 10 مل من 2 × محلول استخلاص + 10 مل من الماء منزوع الأيونات) ، والتي سيتم استخدامها لاستخراج العينات ،يمكن تخزين هذا المحلول عند 4 ℃ لمدة شهر واحد.
المحلول3: محلول غسيل
خفف محلول الغسيل المركز 20 × بالماء منزوع الأيونات بنسبة حجم 1:19 (على سبيل المثال ، 5 مل من 20 × محلول غسيل + 95 مل من الماء منزوع الأيونات) والتي ستستخدم لغسل الأطباق.يمكن تخزين هذا المحلول عند 4 ℃ لمدة شهر واحد.
8. تحضيرات العينة
8.1 ملاحظات واحتياطات قبل العملية:
(أ) يرجى استخدام النصائح لمرة واحدة في عملية التجربة ، وتغيير النصائح عند امتصاص كاشف مختلف.
(ب) تأكد من نظافة جميع الأدوات.
(ج) الحفاظ على عينة الأنسجة في التجميد.
(د) يجب استخدام العينة المحضرة للمقايسة مرة واحدة.
8.2 الأنسجة الحيوانية (الدجاج ، لحم الخنزير ، إلخ)
---- تجانس العينة مع الخالط ؛
---- خذ 2.0 ± 0.05 جرام من التجانس في أنبوب طرد مركزي من البوليسترين سعة 50 مللي ؛أضف 2 مل من 0.2 مليون PB (المحلول1) ، يُرج حتى يذوب ، ثم يضاف 8 مل من أسيتات الإيثيل ويرج بقوة لمدة 3 دقائق ؛
---- جهاز طرد مركزي للفصل: 3000 جرام / درجة حرارة محيطة / 5 دقائق.
---- نقل 4 مل من المرحلة العضوية طاف إلى أنبوب زجاجي 10 مل ، جاف مع حمام مائي 50-60 درجة مئوية تحت تيار غاز النيتروجين ؛
---- قم بإذابة البقايا الجافة باستخدام 1 مل من n-hexane ، ودوامة لمدة 30 ثانية لتذوب ، ثم أضف 1 مل من محلول الاستخراج (المحلول2) ، دوامة لمدة 1 دقيقة.جهاز طرد مركزي للفصل: 3000 جم / درجة حرارة محيطة / 5 دقائق
---- قم بإزالة طور n-hexane الطافي ؛خذ 50 ميكرولتر من المرحلة المائية الركيزة للمقايسة.
عامل التخفيف: 1
8.2 الحليب
---- خذ 100 ميكرولتر من عينة الحليب الخام ، واخلطها مع 900 ميكرولتر من محلول الاستخراج (المحلول2) ، وامزج تماما.
---- خذ 50 مايكرولتر من المحلول المعد للمقايسة.
عامل التخفيف: 10
9. عملية الفحص
9.1 إشعار قبل الفحص
9.1.1تأكد من أن جميع الكواشف والميكروويلات كلها في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).
9.1.2أعد جميع الكواشف المتبقية إلى 2-8℃مباشرة بعد استخدامها.
9.1.3يعد غسل الميكروويلات بشكل صحيح خطوة مهمة في عملية الفحص ؛إنه العامل الحيوي في استنساخ تحليل ELISA.
9.1.4 أإفراغ الضوء وتغطية ميكروويلس أثناء الحضانة.
9.2 خطوات الفحص
9.2.1 أخرج جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لأكثر من 30 دقيقة ، ورجها برفق قبل الاستخدام.
9.2.2 قم بإخراج الميكروويلات اللازمة وأعد الباقي إلى كيس السحاب بدرجة حرارة 2-8 ℃ على الفور.
9.2.3 يجب إعادة تسخين محلول الغسل المخفف إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
9.2.4عدد:يجب ترقيم كل مواقع ميكروويل وجميع المعايير والعينات في نسختين.سجل المعايير والمواقف العينات.
9.2.5Aمحلول قياسي dd / عينة ومحلول جسم مضاد: يضاف 50 مايكرولتر من المحلول القياسي ((مجموعة المقدمة)) أو عينة معدة للآبار المقابلة.أضف 50 مايكرولتر من محلول الجسم المضاد (مجموعة المقدمة).امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الغطاء.
9.2.6غسل: قم بإزالة الغطاء برفق وقم بتنقية السائل من الآبار واشطف الميكروويلات بمحلول غسيل مخفف سعة 250 ميكرولتر (المحلول3) بفاصل 10 ثوانٍ لمدة 4-5 مرات.قم بامتصاص الماء المتبقي بورق ماص (يمكن التخلص من فقاعة الهواء المتبقية بطرف غير مستخدم).
9.2.7أضف الإنزيم المتقارن: أضف 100 مل من محلول الإنزيم المتقارن (مجموعة المقدمة) لكل بئر ، امزج بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ℃ مع غطاء.كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
9.2.8تلوين: يضاف 50 مايكرولتر من المحلول أ (مجموعة المقدمة) و 50 ميكرولتر من المحلول B (مجموعة المقدمة) لكل بئر.تخلط بلطف وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 ℃ مع غطاء.
9.2.9يقيس: أضف 50 مايكرولتر من محلول الإيقاف (مجموعة المقدمة) لكل بئر.اخلط بلطف وقم بقياس الامتصاصية عند 450 نانومتر (يُقترح قياس بطول موجي مزدوج 450/630 نانومتر. اقرأ النتيجة في غضون 5 دقائق بعد إضافة محلول التوقف).
10. النتائج
10.1 نسبة الامتصاص
يتم تقسيم القيم المتوسطة لقيم الامتصاص التي تم الحصول عليها للمعايير والعينات على قيمة الامتصاصية للمعيار الأول (المعيار الصفري) ومضروبة في 100٪.وبذلك يصبح المعيار الصفري مساويًا لـ 100٪ وقيم الامتصاصية مقتبسة في النسب المئوية.
B
الامتصاصية (٪) = --— × 100٪
B0
ب- معيار الامتصاص (أو العينة)
B0 —— معيار الامتصاص الصفري
10.2 المنحنى القياسي
---- لرسم منحنى قياسي: خذ قيمة الامتصاصية للمعايير كمحور ص ، شبه لوغاريتمي لتركيز محلول معايير التيلوزين (جزء في البليون) كمحور س.
---- يتم ضرب تركيز التيلوزين لكل عينة (جزء في البليون) ، والذي يمكن قراءته من منحنى المعايرة ، في عامل التخفيف المقابل لكل عينة متبوعة ، ويتم الحصول على التركيز الفعلي للعينة.
من فضلك لاحظ:
تم تطوير برامج خاصة لتحليل البيانات ، والتي يمكن توفيرها عند الطلب.
11. الحساسية والدقة والدقة
حساسية الاختبار:1.5 جزء في المليون
حد الكشف:
الأنسجة الحيوانية …………………………. ……………… 1.5 جزء في البليون الحليب ………………………………………………… .....… .. 15ppb صحة:
الأنسجة الحيوانية …………………………… ... ………… 80 ± 15٪
الحليب ………………………………… .. ………. …… 80 ± 10٪
دقة:
معامل الاختلاف لمجموعة ELISA أقل من 10٪.
12. إشعار
12.1 سيتم تقليل القيم المتوسطة لقيم الامتصاص التي تم الحصول عليها للمعايير والعينات إذا لم يتم تنظيم الكواشف والعينات لدرجة حرارة الغرفة (20-25).
12.2 لا تدع الميكروويلات تجف بين الخطوات لتجنب التكاثر غير الناجح وقم بتشغيل الخطوة التالية مباشرة بعد النقر على حامل الميكروويلس.
12.3 خض كل مادة كاشفة برفق قبل الاستخدام.
12.4 حافظ على بشرتك بعيدًا عن محلول التوقف لأنها 0.5 مللي أمبير في الساعة2SO4المحلول.
12.5 لا تستخدم مجموعات قديمة.لا تتبادل الكواشف من دفعات مختلفة ، وإلا ستسقط الحساسية.
12.6 حافظ على مجموعات ELISA عند 2-8 ℃ ، لا تجمد.ختم لوحات microwell الراحة ، وتجنب أشعة الشمس المباشرة خلال جميع الحضانات.يوصى بتغطية ألواح الميكروتيتر.
12.7 يجب التخلي عن محلول الركيزة إذا تحول الألوان.قد تصبح الكواشف سيئة إذا كانت قيمة الامتصاصية (450/630 نانومتر) لمعيار الصفر أقل من 0.5 (A450 نانومتر <0.5).
12.8 يحتاج تفاعل التلوين إلى 15 دقيقة بعد إضافة المحلول A والمحلول B. ويمكنك إطالة نطاقات وقت الحضانة إلى 20 دقيقة أو أكثر إذا كان اللون فاتحًا جدًا بحيث يتعذر تحديده.لا تتجاوز 30 دقيقة ، على العكس من ذلك ، اختصر وقت الحضانة بشكل صحيح.
12.9 درجة حرارة التفاعل المثلى هي 37 ℃.سيؤدي ارتفاع درجة الحرارة أو انخفاضها إلى تغيرات في قيم الحساسية والامتصاص.
13. التخزين
حالة التخزين: 2-8 ℃.
فترة التخزين: 12 شهر.
