Pecyn Immunoassay Ensym Cystadleuol ar gyfer Dadansoddiad Meintiol o Tylosin
Pecyn Immunoassay Ensym Cystadleuol ar gyfer
Dadansoddiad Meintiol oTylosin
1. Cefndir
Tylosinyn wrthfiotig macrolide, sy'n cael ei gymhwyso'n bennaf fel gwrthfacterol a gwrth-mycoplasma.Nid yw MRLs llym wedi'u sefydlu gan y gallai'r cyffur hwn arwain at sgîl-effeithiau difrifol mewn rhai grwpiau.
Mae'r pecyn hwn yn gynnyrch newydd sy'n seiliedig ar dechnoleg ELISA, sy'n gyflym, yn hawdd, yn gywir ac yn sensitif o'i gymharu â dadansoddiad offerynnol cyffredin ac sydd angen 1.5 awr yn unig mewn un llawdriniaeth, gall leihau gwall gweithrediad a dwyster gwaith yn sylweddol.
2. Egwyddor Prawf
Mae'r pecyn hwn yn seiliedig ar dechnoleg ELISA anuniongyrchol-gystadleuol.Mae'r ffynhonnau microtiter wedi'u gorchuddio ag antigen cyplu.Mae gweddillion tylosin yn y sampl yn cystadlu â'r antigen sydd wedi'i orchuddio ar y plât microtiter ar gyfer y gwrthgorff.Ar ôl ychwanegu ensym wedi'i labelu gwrth-gwrthgorff, defnyddir swbstrad TMB i ddangos y lliw.Mae cysylltiad negyddol rhwng amsugno'r sampl a'r tylosin sy'n byw ynddo, ar ôl cymharu â'r Gromlin Safonol, wedi'i luosi â'r ffactor gwanhau, gellir cyfrifo maint gweddillion tylosin yn y sampl.
3. Ceisiadau
Gellir defnyddio'r pecyn hwn mewn dadansoddiad meintiol ac ansoddol o weddillion tylosin mewn meinwe anifeiliaid (cyw iâr, porc, hwyaden) a llaeth, mêl, wy, ac ati.
4. Traws-adweithiau
Tylosin…………………………………………..100%
Tilmosin………………………………………………………………………………<2%
5. Deunyddiau Angenrheidiol
5.1 Offer:
---- sbectrophotometer plât microtiter (450nm / 630nm)
---- Anweddydd Rotari neu offerynnau sychu nitrogen
---- homogenizer
---- Ysgwydwr
----Centrifuge
---- Cydbwysedd dadansoddol (anwythiad: 0.01g)
---- Pibed graddedig: 10ml
---- Bwlb pibed rwber
---- Fflasg swmpus: 10ml
---- Tiwbiau centrifuge polystyren: 50ml
---- Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-lluosbig
5.2 Adweithyddion:
----Sodiwm hydrocsid (NaOH, AR)
---- Sodiwm bicarbonad (NaHCO3,AR)
---- Sodiwm carbonad (NaCO3, AR)
---- Asid trichloroacetig (AR)
---- Acetonitrile (AR)
---- asetad ethyl (AR)
┅┅n- Hecsan (AR)
---- Dŵr Deionized
6. Cydrannau Kit
l Plât microtiter gyda 96 o ffynhonnau wedi'u gorchuddio ag antigen
l Atebion safonol (5 potel, 1ml / potel)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Rheolaeth safonol sbeicio: (1ml / potel)1ppm
l Ensym cyfun 1ml……………..…..cap coch
l Hydoddiant gwrthgyrff 7ml……………….……cap gwyrdd
l Ateb A 7ml………………….….……cap gwyn
l Ateb B 7ml...…………………………..cap coch
l Toddiant stop 7ml.……………….…….cap melyn
l toddiant golchi crynodedig 20 × 40ml
…………………………………..…cap tryloyw
l 4 × toddiant echdynnu crynodedig 50ml
……………………………………………….cap glas
7. Paratoi Adweithyddion:
Ateb 1:0.1mol/L ateb NaOH
Pwyswch 0.4g NaOH i 100ml o ddŵr wedi'i ddadïoneiddio a'i gymysgu'n llwyr.
Ateb 2: 1mol/L ateb NaOH
Pwyswch 4g NaOH i 100ml o ddŵr wedi'i ddadïoneiddio a chymysgu'n llwyr.
Ateb 3: halen byffer carbonad
Ateb1: 0.2M PB
Hydoddwch 51.6g o Na2HPO4·12H2O, 8.7g NaH2PO4·2H2O gyda dŵr deionized a gwanhau i 1000ml.
Ateb2: Echdynnu ateb
Gwanhau'r hydoddiant echdynnu crynodedig 2 × â dŵr wedi'i ddadïoneiddio yn y gymhareb cyfaint o 1: 1 (ee 10ml o doddiant echdynnu 2 × + 10ml o ddŵr wedi'i ddadïoneiddio), a ddefnyddir ar gyfer echdynnu sampl,gellir storio'r ateb hwn ar 4 ℃ am 1 mis.
Ateb3: ateb golchi
Gwanhau'r hydoddiant golchi crynodedig 20 × â dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio yn y gymhareb cyfaint o 1:19 (ee 5ml o hydoddiant golchi 20 × + 95ml o ddŵr wedi'i ddadïoneiddio), a fydd yn cael ei ddefnyddio ar gyfer golchi'r platiau.Gellir storio'r ateb hwn ar 4 ℃ am 1 mis.
8. Paratoadau Sampl
8.1 Hysbysiad a rhagofalon cyn gweithredu:
(a) Defnyddiwch awgrymiadau untro yn y broses o arbrofi, a newidiwch y tomenni wrth amsugno gwahanol adweithydd.
(b) Gwnewch yn siŵr bod pob offeryn yn lân.
(c) Cadw sampl meinwe yn y rhewgell.
(d) Dylid defnyddio sampl a baratowyd i'w assay ar unwaith.
8.2 Meinwe anifeiliaid (cyw iâr, porc, ac ati)
---- Homogenize y sampl gyda homogenizer;
---- Cymerwch 2.0 ± 0.05g o homogenad i mewn i diwb centrifuge polystyren 50ml;ychwanegu 2ml o 0.2M PB (ateb1), ysgwyd i doddi, ac yna ychwanegu 8ml o asetad ethyl a'i ysgwyd yn ffyrnig am 3 munud;
---- Centrifuge ar gyfer gwahanu: 3000g / tymheredd amgylchynol / 5 munud.
---- Trosglwyddo 4ml o'r cyfnod organig supernatant i mewn i diwb gwydr 10ml, sych gyda baddon dŵr 50-60 ℃ o dan ffrwd nwy nitrogen;
---- Toddwch y bwyd dros ben sych gyda 1ml o n-hecsan, fortecs am 30au i'w doddi, ac yna ychwanegwch 1ml o hydoddiant echdynnu (ateb2), fortecs am 1 munud.centrifuge ar gyfer gwahanu: 3000g / tymheredd amgylchynol / 5min
---- Cael gwared ar y cyfnod supernatant n-hecsan;cymryd 50μl o gyfnod dyfrllyd y swbstrad ar gyfer assay.
Ffactor gwanhau: 1
8.2 Llaeth
---- Cymerwch 100μl o sampl llaeth amrwd, cymysgwch â 900μl o hydoddiant echdynnu (ateb2), a chymysgwch yn llwyr.
---- Cymerwch 50μl o'r hydoddiant a baratowyd ar gyfer assay.
Ffactor gwanhau: 10
9. Proses Assay
9.1 Hysbysiad cyn assay
9.1.1Sicrhewch fod yr holl adweithyddion a microffynnon i gyd ar dymheredd ystafell (20-25 ℃).
9.1.2Dychwelwch yr holl adweithyddion gweddill i 2-8℃yn syth ar ôl ei ddefnyddio.
9.1.3Mae golchi'r microwells yn gywir yn gam pwysig yn y broses o assay;dyma'r ffactor hanfodol i atgynhyrchu dadansoddiad ELISA.
9.1.4 Agwagiwch y golau a gorchuddiwch y microwells yn ystod y cyfnod magu.
9.2 Camau Profi
9.2.1 Tynnwch yr holl adweithyddion allan ar dymheredd ystafell (20-25 ℃) am fwy na 30 munud, ysgwydwch yn ysgafn cyn ei ddefnyddio.
9.2.2 Cael y microwells sydd eu hangen allan a dychwelyd y gweddill i'r bag clo sip ar 2-8 ℃ ar unwaith.
9.2.3 Dylid ailgynhesu'r hydoddiant golchi gwanedig i fod ar dymheredd ystafell cyn ei ddefnyddio.
9.2.4Rhif:Wedi'i rifo bob safle microwell a dylid rhedeg pob safon a sampl yn ddyblyg.Cofnodwch y safonau a safleoedd samplau.
9.2.5Add datrysiad safonol/sampl a datrysiad gwrthgorff: Ychwanegu 50µl o hydoddiant safonol ((cit a ddarperir)) neu sampl wedi'i baratoi i ffynhonnau cyfatebol.Ychwanegu 50µl o hydoddiant gwrthgorff (cit a ddarperir).Cymysgwch yn ysgafn trwy ysgwyd y plât â llaw a deorwch am 30 munud ar 37 ℃ gyda gorchudd.
9.2.6Golchwch: Tynnwch y clawr yn ysgafn a phurwch yr hylif allan o'r ffynhonnau a rinsiwch y microwells gyda hydoddiant golchi gwanedig 250µl (ateb3) ar egwyl o 10s am 4-5 gwaith.Amsugno'r dŵr gweddilliol gyda phapur amsugnol (gellir dileu'r swigen aer gweddill gyda blaen heb ei ddefnyddio).
9.2.7Ychwanegu ensym cyfun: Ychwanegu 100ml o hydoddiant cyfun ensym (cit a ddarperir) i bob ffynnon, cymysgwch yn ysgafn a deorwch am 30 munud ar 37 ℃ gyda gorchudd.Ailadroddwch y cam golchi eto.
9.2.8Lliwiad: Ychwanegu 50µl o hydoddiant A(cit a ddarperir) a 50µl o hydoddiant B(cit a ddarperir) i bob ffynnon.Cymysgwch yn ysgafn a deorwch am 15 munud ar 37 ℃ gyda gorchudd.
9.2.9Mesur: Ychwanegu 50µl o'r hydoddiant stopio (cit a ddarperir) i bob ffynnon.Cymysgwch yn ysgafn a mesurwch yr amsugnedd ar 450nm (Awgrymir mesur gyda thonfedd ddeuol o 450/630nm. Darllenwch y canlyniad o fewn 5 munud ar ôl ychwanegu hydoddiant stop).
10. Canlyniadau
10.1 Canran yr amsugnedd
Rhennir gwerthoedd cymedrig y gwerthoedd amsugno a gafwyd ar gyfer y safonau a'r samplau â gwerth amsugnedd y safon gyntaf (safon sero) a'i luosi â 100%.Felly gwneir y safon sero yn hafal i 100% a dyfynnir y gwerthoedd amsugno mewn canrannau.
B
Amsugno (%) = —— × 100%
B0
B —— safon amsugno (neu sampl)
B0 ——safon amsugno sero
10.2 Cromlin Safonol
---- I dynnu cromlin safonol: Cymerwch werth amsugnedd safonau fel echel-y, lled logarithmig crynodiad yr hydoddiant safonau tylosin (ppb) fel echelin-x.
---- Mae crynodiad tylosin pob sampl (ppb), y gellir ei ddarllen o'r gromlin graddnodi, yn cael ei luosi â ffactor gwanhau cyfatebol pob sampl a ddilynir, a cheir crynodiad gwirioneddol y sampl.
Sylwch os gwelwch yn dda:
mae meddalwedd arbennig wedi'i ddatblygu ar gyfer dadansoddi data, y gellir ei ddarparu ar gais.
11. Sensitifrwydd, cywirdeb a manwl gywirdeb
Sensitifrwydd Prawf:1.5ppb
Terfyn canfod:
Meinwe anifeiliaid ………………………….……………1.5ppb Llaeth……………………………………………………………………………..…..15ppb Cywirdeb:
Meinwe anifeiliaid …………………………...…………80±15%
Llaeth……………………………..……….……80±10%
trachywiredd:
Mae cyfernod amrywiad pecyn ELISA yn llai na 10%.
12. Hysbysiad
12.1 Bydd gwerthoedd cymedrig y gwerthoedd amsugno a gafwyd ar gyfer y safonau a'r samplau yn cael eu lleihau os nad yw'r adweithyddion a'r samplau wedi'u rheoleiddio i dymheredd ystafell (20-25 ℃).
12.2 Peidiwch â gadael i microwells sychu rhwng camau er mwyn osgoi atgynhyrchu aflwyddiannus a gweithredu'r cam nesaf yn syth ar ôl tapio deiliad y microwells.
12.3 Ysgwydwch bob adweithydd yn ysgafn cyn ei ddefnyddio.
12.4 Cadwch eich croen i ffwrdd o'r toddiant stopio oherwydd ei fod yn 0.5MH2SO4ateb.
12.5 Peidiwch â defnyddio'r pecynnau sydd wedi dyddio.Peidiwch â chyfnewid adweithyddion gwahanol sypiau, neu fel arall bydd yn gollwng y sensitifrwydd.
12.6 Cadwch y pecynnau ELISA ar 2-8 ℃, peidiwch â rhewi.Selio platiau microwell gorffwys, Osgoi golau haul syth yn ystod pob deoriad.Argymhellir gorchuddio'r platiau microtiter.
12.7 Dylid rhoi'r gorau i ateb swbstrad os yw'n troi lliwiau.Gall yr adweithyddion droi'n ddrwg os yw gwerth amsugnedd (450/630nm) y safon sero yn llai na 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 Mae angen yr adwaith lliwio 15 munud ar ôl ychwanegu hydoddiant A a hydoddiant B. A gallwch chi ymestyn yr amser deori i 20 munud neu fwy os yw'r lliw yn rhy ysgafn i'w bennu.Peidiwch byth â bod yn fwy na 30 munud, i'r gwrthwyneb, cwtogwch yr amser deori yn iawn.
12.9 Y tymheredd adwaith gorau posibl yw 37 ℃.Bydd tymheredd uwch neu is yn arwain at newid gwerthoedd sensitifrwydd ac amsugno.
13. storio
Cyflwr storio: 2-8 ℃.
Cyfnod storio: 12 mis.
