Komplet kompetitivnog enzimskog imunološkog testa za kvantitativnu analizu tilozina
Komplet za kompetitivni enzimski imunološki test
Kvantitativna analizatilozin
1. Pozadina
tilozinje makrolidni antibiotik, koji se uglavnom primjenjuje kao antibakterijski i antimikoplazmatski.Utvrđeni su strogi MRL-ovi jer ovaj lijek može uzrokovati ozbiljne nuspojave u određenim skupinama.
Ovaj kit je novi proizvod temeljen na ELISA tehnologiji, koja je brza, laka, točna i osjetljiva u usporedbi s uobičajenom instrumentalnom analizom i treba joj samo 1,5 sat u jednoj operaciji, može znatno smanjiti radnu grešku i intenzitet rada.
2. Načelo ispitivanja
Ovaj se komplet temelji na neizravno-kompetitivnoj ELISA tehnologiji.Mikrotitarske jažice obložene su antigenom za spajanje.Ostatak tilozina u uzorku natječe se s antigenom obloženim na mikrotitarskoj ploči za antitijelo.Nakon dodavanja enzimom obilježenog anti-antitijela, TMB supstrat se koristi za prikaz boje.Apsorpcija uzorka negativno je povezana s tilozinom koji se nalazi u njemu, nakon usporedbe sa standardnom krivuljom, pomnoženom s faktorom razrjeđenja, može se izračunati količina ostatka tilozina u uzorku.
3. Prijave
Ovaj pribor se može koristiti u kvantitativnoj i kvalitativnoj analizi ostataka tilozina u životinjskom tkivu (piletina, svinjetina, patka) i mlijeku, medu, jajima itd.
4. Križne reakcije
Tilozin…………………………………………………..100%
Tilmikozin………………………………………………<2%
5. Potrebni materijali
5.1 Oprema:
----Spektrofotometar mikrotitarske ploče (450nm/630nm)
---- Rotacijski isparivač ili instrumenti za sušenje dušikom
----homogenizator
----Shaker
----Centrifuga
----Analitička vaga (induktivnost: 0,01g)
----Graduirana pipeta: 10 ml
----Gumena kuglica pipete
----Odmjerna tikvica: 10 ml
---- Polistirenske epruvete za centrifugiranje: 50 ml
----Mikropipete: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipeta
5.2 Reagensi:
----Natrijev hidroksid (NaOH, AR)
---- Natrijev bikarbonat (NaHCO3,AR)
---- Natrijev karbonat (NaCO3, AR)
----trikloroctena kiselina (AR)
---- Acetonitril (AR)
----Etil acetat (AR)
┅┅n-heksan (AR)
----Deionizirana voda
6. Komponente kompleta
l Mikrotitarska ploča s 96 jažica obloženih antigenom
l Standardne otopine (5 bočica, 1 ml/bočica)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Standardna kontrola dodavanja: (1 ml/bočica)1 ppm
l Enzimski konjugat 1 ml……………..…..…crvena kapa
l Otopina protutijela 7 ml……………….……zelena kapa
l Otopina A 7 ml…………………….….……bijela kapica
l Otopina B 7ml...……………………………..crveni čep
l Stop otopina 7 ml.……………….……….žuti čep
l 20×koncentrirana otopina za pranje 40ml
…………………………………..…prozirni čep
l 4×koncentrirana otopina za ekstrakciju 50ml
……………………………………………….plava kapa
7. Priprema reagensa:
Rješenje 1:0,1 mol/L otopina NaOH
Izvažite 0,4 g NaOH u 100 ml deionizirane vode i potpuno promiješajte.
Rješenje 2: 1mol/L otopina NaOH
Izvažite 4 g NaOH u 100 ml deionizirane vode i potpuno promiješajte.
Rješenje 3: Karbonatna puferska sol
Riješenje1: 0,2M PB
Otopiti 51,6 g Na2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O s deioniziranom vodom i razrijedite do 1000 ml.
Riješenje2: Otopina za ekstrakciju
Razrijedite 2× koncentriranu otopinu za ekstrakciju deioniziranom vodom u volumnom omjeru 1:1(npr. 10ml 2×ekstrakcijske otopine + 10ml deionizirane vode), koji će se koristiti za ekstrakciju uzorka,ova se otopina može čuvati na 4 ℃ 1 mjesec.
Riješenje3: Otopina za pranje
Razrijedite 20 x koncentriranu otopinu za pranje s deioniziranom vodom u volumnom omjeru 1:19 (npr. 5ml 20×wash otopine + 95ml deionizirane vode), koji će se koristiti za pranje tanjura.Ova otopina može se čuvati na 4 ℃ 1 mjesec.
8. Pripreme uzoraka
8.1 Obavijest i mjere opreza prije rada:
(a) Koristite jednokratne vrhove u procesu eksperimenta i mijenjajte vrhove kada apsorbirate drugi reagens.
(b) Provjerite jesu li svi instrumenti čisti.
(c) Držite uzorak tkiva u zamrzivaču.
(d) Pripremljeni uzorak treba odmah upotrijebiti za analizu.
8.2 Životinjsko tkivo (pileće, svinjsko, itd.)
----Homogenizirati uzorak homogenizatorom;
----Uzmite 2,0±0,05 g homogenata u polistirensku epruvetu za centrifugiranje od 50 ml;dodajte 2 ml 0,2 M PB (riješenje1), protresite da se otopi, a zatim dodajte 8 ml etil acetata i snažno protresite 3 minute;
----Centrifuga za odvajanje: 3000g / sobna temperatura / 5min.
---- Prenesite 4 ml supernatanta organske faze u staklenu epruvetu od 10 ml, osušite u vodenoj kupelji na 50-60 ℃ pod strujom plinovitog dušika;
---- Otopite suhi ostatak s 1 ml n-heksana, miješajte 30 sekundi da se otopi, a zatim dodajte 1 ml otopine za ekstrakciju (riješenje2), vrtložite 1 minutu.centrifuga za odvajanje: 3000g / sobna temperatura / 5min
----Ukloniti supernatant n-heksanske faze;uzmite 50 μl vodene faze supstrata za analizu.
Faktor razrjeđivanja: 1
8.2 Mlijeko
----Uzmite 100 μl uzorka sirovog mlijeka, pomiješajte s 900 μl otopine za ekstrakciju (riješenje2) i potpuno promiješajte.
---- Uzmite 50 μl pripremljene otopine za analizu.
Faktor razrjeđivanja: 10
9. Postupak ispitivanja
9.1 Obavijest prije analize
9.1.1Provjerite jesu li svi reagensi i mikrojažice na sobnoj temperaturi (20-25 ℃).
9.1.2Vratite sve ostale reagense na 2-8℃odmah nakon upotrebe.
9.1.3Ispravno pranje mikrojažica važan je korak u procesu analize;to je vitalni faktor za ponovljivost ELISA analize.
9.1.4 Aponištite svjetlo i prekrijte mikrojažice tijekom inkubacije.
9.2 Koraci ispitivanja
9.2.1 Izvadite sve reagense na sobnoj temperaturi (20-25 ℃) dulje od 30 minuta, lagano protresite prije upotrebe.
9.2.2 Izvadite potrebne mikrojažice i odmah vratite ostatak u vrećicu sa zatvaračem na 2-8 ℃.
9.2.3 Razrijeđenu otopinu za ispiranje treba ponovno zagrijati na sobnu temperaturu prije upotrebe.
9.2.4Broj:Numerirajte svaku poziciju mikrojažice i sve standarde i uzorke treba izvoditi u duplikatu.Zabilježite položaje standarda i uzoraka.
9.2.5Add standardna otopina/uzorak i otopina protutijela: Dodajte 50µl standardne otopine((priložen komplet)) ili pripremljeni uzorak u odgovarajuće jažice.Dodajte 50 µl otopine antitijela (priložen komplet).Lagano promiješajte ručnim protresanjem ploče i inkubirajte 30 minuta na 37 ℃ s poklopcem.
9.2.6Pranje: Nježno uklonite poklopac i očistite tekućinu iz jažica i isperite mikrojažice s 250 µl razrijeđene otopine za pranje (riješenje3) u intervalu od 10 s 4-5 puta.Upijte preostalu vodu upijajućim papirom (ostatak mjehurića zraka možete ukloniti neiskorištenim vrhom).
9.2.7Dodajte enzimski konjugat: Dodajte 100 ml otopine enzimskog konjugata (priložen komplet) u svaku jažicu, lagano promiješajte i inkubirajte 30 minuta na 37 ℃ s poklopcem.Ponovno ponovite korak pranja.
9.2.8Obojenost: Dodajte 50µl otopine A(priložen komplet) i 50µl otopine B(priložen komplet) u svaku bušotinu.Lagano promiješajte i inkubirajte 15 minuta na 37 ℃ s poklopcem.
9.2.9Mjera: Dodajte 50 µl stop otopine (priložen komplet) u svaku bušotinu.Lagano promiješajte i izmjerite apsorbanciju na 450 nm (preporučuje se mjerenje s dvostrukom valnom duljinom od 450/630 nm. Očitajte rezultat unutar 5 minuta nakon dodavanja otopine za zaustavljanje).
10. Rezultati
10.1 Postotak apsorbancije
Srednje vrijednosti vrijednosti apsorbancije dobivene za standarde i uzorke dijele se s vrijednošću apsorbancije prvog standarda (nulti standard) i množe sa 100%.Nulti standard je stoga jednak 100%, a vrijednosti apsorbancije navedene su u postocima.
B
Apsorpcija (%) = —— ×100%
B0
B ——standard apsorpcije (ili uzorak)
B0 ——standard apsorpcije nula
10.2 Standardna krivulja
----Za crtanje standardne krivulje: Uzmite vrijednost apsorbancije standarda kao y-os, polulogaritamsku koncentraciju standardne otopine tilozina (ppb) kao x-os.
----Koncentracija tilozina u svakom uzorku (ppb), koja se može očitati iz kalibracijske krivulje, množi se s odgovarajućim faktorom razrjeđenja svakog uzorka koji se prati i dobiva se stvarna koncentracija uzorka.
Napomena:
razvijen je poseban softver za analizu podataka koji se može dobiti na zahtjev.
11. Osjetljivost, točnost i preciznost
Test osjetljivosti:1,5 ppb
Granica detekcije:
Životinjsko tkivo………………………….……………1,5 ppb Mlijeko…………………………………………….....…..15 ppb Točnost:
Životinjsko tkivo…………………………………………80±15%
Mlijeko……………………………………..……….……80±10%
Preciznost:
Koeficijent varijacije ELISA kita manji je od 10%.
12. Obavijest
12.1 Srednje vrijednosti vrijednosti apsorbancije dobivene za standarde i uzorke smanjit će se ako reagensi i uzorci nisu podešeni na sobnu temperaturu (20-25 ℃).
12.2 Nemojte dopustiti da se mikrojažice osuše između koraka kako biste izbjegli neuspješnu ponovljivost i izvršite sljedeći korak odmah nakon što dodirnete držač mikrojažica.
12.3 Lagano protresite svaki reagens prije upotrebe.
12.4 Držite kožu podalje od stop otopine jer je ona 0,5 MH2SO4riješenje.
12.5 Nemojte koristiti komplete koji su zastarjeli.Ne mijenjajte reagense iz različitih serija jer će u suprotnom doći do pada osjetljivosti.
12.6 Čuvajte komplete ELISA na 2-8 ℃, nemojte zamrzavati.Zatvorite pločice s mikrootvorima, izbjegavajte izravnu sunčevu svjetlost tijekom svih inkubacija.Preporuča se prekrivanje mikrotitarskih ploča.
12.7 Otopinu supstrata treba napustiti ako oboji.Reagensi mogu biti loši ako je vrijednost apsorbancije (450/630 nm) nultog standarda manja od 0,5 (A450 nm<0,5).
12.8 Reakcija obojenja treba 15 minuta nakon dodavanja otopine A i otopine B. Možete produljiti raspon vremena inkubacije na 20 minuta ili više ako je boja presvijetla da bi se odredila.Nikada nemojte prekoračiti 30min, naprotiv, pravilno skratite vrijeme inkubacije.
12.9 Optimalna temperatura reakcije je 37 ℃.Viša ili niža temperatura dovest će do promjena osjetljivosti i vrijednosti apsorbancije.
13. Skladištenje
Uvjeti skladištenja: 2-8 ℃.
Rok skladištenja: 12 mjeseci.
