өнім

1. Фон

Тилозинмакролидті антибиотик болып табылады, ол негізінен бактерияға қарсы және микоплазмаға қарсы қолданылады.Бұл препарат белгілі бір топтарда елеулі жанама әсерлерге әкелуі мүмкін болғандықтан, қатаң MRL белгіленді.

Бұл жинақ ELISA технологиясына негізделген жаңа өнім болып табылады, ол қарапайым аспаптық талдаумен салыстырғанда жылдам, оңай, дәл және сезімтал және бір операцияда бар болғаны 1,5 сағатты қажет етеді, ол операция қатесін және жұмыс қарқындылығын айтарлықтай азайтады.

2. Тест принципі

Бұл жинақ жанама бәсекеге қабілетті ELISA технологиясына негізделген.Микротитр ұңғымалары байланыстырушы антигенмен қапталған.Үлгідегі тилозин қалдығы антидене үшін микротитр пластинасында қапталған антигенмен бәсекелеседі.Антидене таңбаланған ферментті қосқаннан кейін түсті көрсету үшін TMB субстраты қолданылады.Үлгінің абсорбциясы ондағы тилозинге теріс байланысты, сұйылту коэффициентіне көбейтілген Стандартты қисықпен салыстырғаннан кейін үлгідегі тилозин қалдығының мөлшерін есептеуге болады.

3. Қолданбалар

Бұл жинақты жануарлардың ұлпаларындағы (тауық, шошқа, үйрек) және сүт, бал, жұмыртқа және т.б. тилозин қалдықтарының сандық және сапалық талдауында қолдануға болады.

4. Айқас реакциялар

Тилозин……………………………………………..100%

Тилмикозин……………………………………………<2%

5. Қажетті материалдар

5.1 Жабдықтар:

----Микротитр пластинасының спектрофотометрі (450нм/630нм)

----Айналмалы буландырғыш немесе азот кептіргіш аспаптар

----гомогенизатор

----Шейкер

----Центрифуга

----Аналитикалық баланс (индуктивтілік: 0,01г)

----Бөлген тамшуыр: 10 мл

----Резеңке тамшуыр шамы

----Көлемді колба: 10мл

----Полистирол центрифуга түтіктері: 50мл

----Микропипеттер: 20-200мл, 100-1000мл

250 мл мультипипетка

5.2 Реагенттер:

----Натрий гидроксиді (NaOH, AR)

----Натрий гидрокарбонаты (NaHCO_3,AR)

---- Натрий карбонаты (NaCO₃, AR)

----Трихлорсірке қышқылы (AR)

---- Ацетонитрил (AR)

----Этилацетат (AR)

┅┅n-гексан (AR)

----Дионсыздандырылған су

6. Жинақ құрамдастары

l Антигенмен қапталған 96 шұңқыры бар микротитр тақтасы

l Стандартты ерітінділер (5 бөтелке, 1 мл/бөтелке)

0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb

l Шығуды стандартты бақылау: (1 мл/бөтелке)1 бет/мин

l Фермент конъюгаты 1мл……………………….…қызыл қалпақ

l Антидене ерітіндісі 7мл……………….……жасыл қалпақ

l A ерітіндісі 7мл…………………….….……ақ қақпақ

l B ерітіндісі 7мл……………………………..қызыл қалпақ

l Тоқтатқыш ерітінді 7мл.……………….……….сары қалпақ

л 20×концентрлі жуу ерітіндісі 40мл

………………………………..…мөлдір қалпақ

л 4×концентрлі экстракциялық ерітінді 50мл

……………………………………………….көк қалпақ

7. Реагенттерді дайындау:

Шешім 1:0,1моль/л NaOH ерітіндісі

100 мл ионсыздандырылған суға 0,4 г NaOH өлшеп, толығымен араластырыңыз.

Шешім 2: 1моль/л NaOH ерітіндісі

100 мл деиондалған суға 4 г NaOH өлшеп, толығымен араластырыңыз.

Шешім 3: Карбонатты буфер тұзы

Шешім1: 0,2 M PB

51,6 г Na ерітіңіз₂HPO₄·12 сағ₂O, 8,7 г NaH₂PO₄· 2H₂О деионизацияланған сумен және 1000 мл дейін сұйылтыңыз.

Шешім2: Экстракциялық ерітінді

2×концентрлі экстракция ерітіндісін 1:1 көлемдік қатынасында ионсыздандырылған сумен сұйылтыңыз.мысалы 10мл 2хэкстракция ерітіндісі + 10мл деиондандырылған су), үлгі алу үшін пайдаланылатын,бұл ерітіндіні 4℃ температурада 1 ай сақтауға болады.

Шешім3: Жуу ерітіндісі

20 × концентрлі жуу ерітіндісін 1:19 көлемдік қатынасында ионсыздандырылған сумен сұйылтыңыз.мысалы, 5 мл 20 × жуу ерітіндісі + 95 мл ионсыздандырылған су), ол пластиналарды жуу үшін пайдаланылады.Бұл ерітіндіні 4 ° C температурада 1 ай сақтауға болады.

8. Дайындау үлгілері

8.1 Жұмыс алдында ескерту және сақтық шаралары:

(a) Тәжірибе барысында бір реттік кеңестерді пайдаланыңыз және әртүрлі реагентті сіңірген кезде кеңестерді өзгертіңіз.

(b) Барлық құралдардың таза екеніне көз жеткізіңіз.

(c) Тін үлгісін мұздатқышта сақтаңыз.

(d) Дайындалған үлгіні талдау үшін бірден пайдалану керек.

8.2 Жануарлар тіндері (тауық, шошқа еті және т.б.)

----Үлгіні гомогенизатормен гомогенизациялау;

----50 мл полистирол центрифугасының түтігіне 2,0±0,05 г гомогенатты алыңыз;2 мл 0,2 М ПБ қосыңыз (шешім1) , еріту үшін шайқаңыз, содан кейін 8 мл этилацетатты қосып, 3 минут бойы қатты шайқаңыз;

----Ажыратуға арналған центрифуга: 3000г / қоршаған орта температурасы / 5мин.

---- 4 мл үстіңгі органикалық фазаны 10 мл шыны түтікке құйыңыз, азот газы ағыны астында 50-60 ℃ су моншасында кептіріңіз;

---- Құрғақ қалдықты 1 мл n-гексанмен ерітіңіз, еріту үшін 30 секунд құйыңыз, содан кейін 1 мл экстракция ерітіндісін қосыңыз (шешім2) құйынды 1 мин.бөлуге арналған центрифуга: 3000г / қоршаған орта температурасы / 5 мин

----Н-гексан фазасының үстіңгі қабатын алып тастаңыз;талдау үшін субстраттың сулы фазасынан 50 мкл алыңыз.

Сұйылту коэффициенті: 1

8.2 Сүт

---- 100 мкл шикі сүт үлгісін алыңыз, 900 мкл экстракция ерітіндісімен араластырыңыз (шешім2) және толығымен араластырыңыз.

---- Талдау үшін дайындалған ерітіндіден 50 мкл алыңыз.

Сұйылту коэффициенті: 10

9. Талдау процесі

9.1 Талдау алдында ескерту

9.1.1Барлық реагенттер мен шағын түтіктердің барлығы бөлме температурасында (20-25℃) екеніне көз жеткізіңіз.

9.1.2Барлық қалған реагенттерді 2-8-ге қайтарыңыз℃пайдаланғаннан кейін бірден.

9.1.3Шағын түтіктерді дұрыс жуу талдау процесіндегі маңызды қадам болып табылады;бұл ELISA талдауының қайталану мүмкіндігінің маңызды факторы болып табылады.

9.1.4 Ажарықты өшіріп, инкубация кезінде микроқұдықтарды жабыңыз.

9.2 Талдау қадамдары

9.2.1 Барлық реагенттерді бөлме температурасында (20-25℃) 30 минуттан астам уақытқа алыңыз, қолданар алдында ақырын шайқаңыз.

9.2.2 Қажетті шағын шұңқырларды алыңыз да, қалғандарын 2-8℃ температурада дереу құлыпталатын қапшыққа салыңыз.

9.2.3 Қолданар алдында сұйылтылған жуу ерітіндісін бөлме температурасында қайта жылыту керек.

9.2.4Саны:Әрбір шағын түтік позициялары нөмірленген және барлық стандарттар мен үлгілер екі данада орындалуы керек.Стандарттар мен үлгілердің позицияларын жазып алыңыз.

9.2.5Add стандартты ерітінді/үлгі және антидене ерітіндісі: 50 мкл стандартты ерітінді қосыңыз((жинақ берілген)) немесе сәйкес ұңғымаларға дайындалған сынама.50мкл антидене ерітіндісін қосыңыз(жинақ берілген).Пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және қақпағымен 37°C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз.

9.2.6Жуу: Қақпақты ақырын алып тастаңыз және сұйықтықты ұңғымалардан тазалаңыз және шағын түтіктерді 250 мкл сұйылтылған жуу ерітіндісімен шайыңыз (шешім3) 10 секунд аралықпен 4-5 рет.Қалған суды сіңіргіш қағазбен сорыңыз (қалған ауа көпіршігі пайдаланылмаған ұшымен жойылуы мүмкін).

9.2.7Фермент конъюгаты қосыңыз: 100 мл фермент конъюгат ерітіндісін қосыңыз(жинақ берілген) әрбір ұңғымаға ақырын араластырыңыз және қақпақпен 37°C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз.Жуу қадамын қайтадан қайталаңыз.

9.2.8Түс беру: 50мкл А ерітіндісін қосыңыз(жинақ берілген) және 50мкл B ерітіндісі(жинақ берілген) әрбір ұңғымаға.Ақырын араластырыңыз және қақпақпен 37°C температурада 15 минут инкубациялаңыз.

9.2.9Өлшеу: 50 мкл тоқтату ерітіндісін қосыңыз(жинақ берілген) әрбір ұңғымаға.Ақырын араластырыңыз және сіңіруді 450 нм-де өлшеңіз (Бұл 450/630 нм қос толқын ұзындығымен ұсынылған өлшем. Тоқтатқыш ерітіндіні қосқаннан кейін 5 минут ішінде нәтижені оқыңыз).

10. Нәтижелер

10.1 Пайыздық сіңіру

Стандарттар мен үлгілер үшін алынған жұтылу мәндерінің орташа мәндері бірінші эталонның (нөлдік эталон) сіңіру мәніне бөлінеді және 100%-ға көбейтіледі.Осылайша, нөлдік стандарт 100% тең етіп жасалады және сіңіру мәндері пайызбен белгіленеді.

B

Абсорбция (%) = —— ×100%

B0

B —— сіңіру стандарты (немесе үлгі)

B0 —— жұтылу нөлдік стандарты

10.2 Стандартты қисық

----Стандартты қисық сызу үшін: эталондардың жұтылу мәнін y осі ретінде, тилозин эталондар ерітіндісінің (ppb) концентрациясының жартылай логарифмдік мәнін x осі ретінде алыңыз.

----Калибрлеу қисығынан оқуға болатын әрбір үлгідегі тилозин концентрациясы (ppb) әрбір бақыланатын үлгінің сәйкес сұйылту коэффициентіне көбейтіледі және үлгінің нақты концентрациясы алынады.

Назар аударыңыз:

деректерді талдау үшін арнайы бағдарламалық қамтамасыз ету әзірленді, ол сұраныс бойынша ұсынылуы мүмкін.

11. Сезімталдық, дәлдік және дәлдік

Сынақ сезімталдығы:1,5бб

Анықтау шегі:

Жануарлар ұлпасы………………………………………1,5 ppb Сүт………………………………………………..15бб Дәлдігі:

Жануарлар ұлпасы………………………………………80±15%

Сүт……………………………………………………………80±10%

Дәлдік:

ELISA жинағының вариация коэффициенті 10%-дан аз.

12. Ескерту

12.1 Стандарттар мен үлгілер үшін алынған сіңіру мәндерінің орташа мәндері, егер реагенттер мен үлгілер бөлме температурасына (20-25℃) дейін реттелмесе, төмендейді.

12.2 Сәтсіз қайталануды болдырмау үшін қадамдар арасында шағын түтіктердің кептірілуіне жол бермеңіз және шағын түтік ұстағышын түрткеннен кейін бірден келесі қадамды орындаңыз.

12.3 Қолданар алдында әрбір реагентті ақырын шайқаңыз.

12.4 Теріңізді тоқтату ерітіндісінен алыс ұстаңыз, себебі ол 0,5 МГ₂SO₄шешім.

12.5 Ескірген жинақтарды пайдаланбаңыз.Әртүрлі партиялардың реагенттерін алмастырмаңыз, әйтпесе ол сезімталдықты төмендетеді.

12.6 ELISA жинақтарын 2-8℃ температурада ұстаңыз, қатып қалмаңыз.Шағын шұңқырларды жабыңыз, барлық инкубациялар кезінде тікелей күн сәулесінен аулақ болыңыз.Микротитрлік тақталарды жабу ұсынылады.

12.7 Субстрат ерітіндісінің түсі өзгерсе, оны тастау керек.Нөлдік стандарттың сіңіру мәні (450/630нм) 0,5-тен (A450nm<0,5) төмен болса, реагенттер нашар болуы мүмкін.

12.8 Бояу реакциясына А ерітіндісі мен В ерітіндісі қосылғаннан кейін 15 минут қажет. Түс анықтау үшін тым ашық болса, инкубация уақытын 20 минутқа немесе одан да көп ұзартуға болады.Ешқашан 30 минуттан асырмаңыз, керісінше инкубация уақытын дұрыс қысқартыңыз.

12.9 Оңтайлы реакция температурасы 37℃.Жоғары немесе төмен температура сезімталдық пен сіңіру мәндерінің өзгеруіне әкеледі.

13. Сақтау

Сақтау жағдайы: 2-8℃.

Сақтау мерзімі: 12 ай.