டைலோசினின் அளவு பகுப்பாய்வுக்கான போட்டி என்சைம் இம்யூனோசே கிட்
போட்டி என்சைம் இம்யூனோஅசே கிட்
அளவு பகுப்பாய்வுடைலோசின்
1. பின்னணி
டைலோசின்ஒரு மேக்ரோலைடு ஆண்டிபயாடிக் ஆகும், இது முக்கியமாக பாக்டீரியா எதிர்ப்பு மற்றும் ஆன்டி-மைக்கோபிளாஸ்மாவாக பயன்படுத்தப்படுகிறது.இந்த மருந்து சில குழுக்களில் கடுமையான பக்க விளைவுகளுக்கு வழிவகுக்கும் என்பதால் கடுமையான MRL கள் நிறுவப்பட்டுள்ளன.
இந்த கிட் ELISA தொழில்நுட்பத்தை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஒரு புதிய தயாரிப்பாகும், இது பொதுவான கருவிப் பகுப்பாய்வோடு ஒப்பிடும்போது வேகமானது, எளிதானது, துல்லியமானது மற்றும் உணர்திறன் கொண்டது மற்றும் ஒரு செயல்பாட்டிற்கு 1.5 மணிநேரம் மட்டுமே தேவைப்படுகிறது, இது செயல்பாட்டின் பிழை மற்றும் வேலை தீவிரத்தை கணிசமாகக் குறைக்கும்.
2. சோதனைக் கோட்பாடு
இந்த கிட் மறைமுக-போட்டி ELISA தொழில்நுட்பத்தை அடிப்படையாகக் கொண்டது.மைக்ரோடிட்டர் கிணறுகள் இணைக்கும் ஆன்டிஜெனுடன் பூசப்பட்டிருக்கும்.மாதிரியில் உள்ள டைலோசின் எச்சம் ஆன்டிபாடிக்காக மைக்ரோடிட்டர் தட்டில் பூசப்பட்ட ஆன்டிஜெனுடன் போட்டியிடுகிறது.ஆன்டிபாடி என பெயரிடப்பட்ட நொதியைச் சேர்த்த பிறகு, நிறத்தைக் காட்ட TMB அடி மூலக்கூறு பயன்படுத்தப்படுகிறது.மாதிரியின் உறிஞ்சுதல் அதில் உள்ள டைலோசினுடன் எதிர்மறையாக தொடர்புடையது, நிலையான வளைவுடன் ஒப்பிட்டு, நீர்த்த காரணியால் பெருக்கி, மாதிரியில் உள்ள டைலோசின் எச்சத்தின் அளவைக் கணக்கிடலாம்.
3. விண்ணப்பங்கள்
விலங்கு திசுக்களில் (கோழி, பன்றி இறைச்சி, வாத்து) மற்றும் பால், தேன், முட்டை போன்றவற்றில் உள்ள டைலோசின் எச்சத்தின் அளவு மற்றும் தரமான பகுப்பாய்வில் இந்த கிட் பயன்படுத்தப்படலாம்.
4. குறுக்கு எதிர்வினைகள்
டைலோசின்………………………………………………..100%
டில்மிகோசின்………………………………………… 2%
5. தேவையான பொருட்கள்
5.1 உபகரணங்கள்:
----மைக்ரோடைட்டர் பிளேட் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர் (450nm/630nm)
----ரோட்டரி ஆவியாக்கி அல்லது நைட்ரஜன் உலர்த்தும் கருவிகள்
----ஒத்திசைப்பான்
---- சேகர்
----மையவிலக்கு
---- பகுப்பாய்வு சமநிலை (தூண்டல்: 0.01 கிராம்)
----பட்டம் பெற்ற பைப்பட்: 10மிலி
----ரப்பர் பைப்பட் பல்ப்
----வால்யூமெட்ரிக் குடுவை: 10மிலி
----பாலிஸ்டிரீன் மையவிலக்கு குழாய்கள்: 50மிலி
----மைக்ரோபிபெட்டுகள்: 20-200மிலி, 100-1000மிலி
250மிலி-மல்டிபிபெட்
5.2 எதிர்வினைகள்:
----சோடியம் ஹைட்ராக்சைடு (NaOH, AR)
----சோடியம் பைகார்பனேட் (NaHCO3,AR)
---- சோடியம் கார்பனேட் (NaCO3, AR)
----டிரைகுளோரோஅசெடிக் அமிலம் (AR)
---- அசிட்டோனிட்ரைல் (AR)
----எத்தில் அசிடேட் (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
---- டீயோனைஸ்டு நீர்
6. கிட் கூறுகள்
l ஆன்டிஜென் பூசப்பட்ட 96 கிணறுகள் கொண்ட மைக்ரோடிட்டர் தட்டு
நிலையான தீர்வுகள் (5 பாட்டில்கள், 1 மிலி/பாட்டில்)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
ஸ்பைக்கிங் நிலையான கட்டுப்பாடு: (1மிலி/பாட்டில்)1 பிபிஎம்
l என்சைம் கன்ஜுகேட் 1மிலி ………………………..சிவப்பு தொப்பி
ஆன்டிபாடி கரைசல் 7மிலி………………………… பச்சை தொப்பி
l தீர்வு A 7ml…………………………………… வெள்ளை தொப்பி
l கரைசல் B 7ml.............................................. சிவப்பு தொப்பி
l நிறுத்தக் கரைசல் 7மிலி.……………………………… மஞ்சள் தொப்பி
l 20× செறிவூட்டப்பட்ட கழுவும் தீர்வு 40 மிலி
……………………………………… வெளிப்படையான தொப்பி
l 4× செறிவூட்டப்பட்ட பிரித்தெடுத்தல் தீர்வு 50 மிலி
…………………………………………… நீல நிற தொப்பி
7. எதிர்வினைகள் தயாரிப்பு:
தீர்வு 1:0.1mol/L NaOH கரைசல்
0.4 கிராம் NaOH முதல் 100 மில்லி டீயோனைஸ்டு நீர் வரை எடையும் மற்றும் முழுமையாக கலக்கவும்.
தீர்வு 2: 1mol/L NaOH கரைசல்
4 கிராம் NaOH முதல் 100 மில்லி டீயோனைஸ்டு நீர் வரை எடையும், முழுமையாக கலக்கவும்.
தீர்வு 3: கார்பனேட் பஃபர் உப்பு
தீர்வு1: 0.2M பிபி
நாவின் 51.6 கிராம் கரைக்கவும்2HPO4·12H2O, NaH இன் 8.7 கிராம்2PO4·2எச்2டீயோனைஸ்டு நீர் மற்றும் 1000மிலி நீர்த்த.
தீர்வு2: பிரித்தெடுத்தல் தீர்வு
2× செறிவூட்டப்பட்ட பிரித்தெடுத்தல் கரைசலை 1:1 என்ற அளவு விகிதத்தில் டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட தண்ணீருடன் நீர்த்துப்போகச் செய்யுங்கள்.எ.கா. 10மிலி 2×பிரித்தல் கரைசல் + 10மிலி டீயோனைஸ்டு நீர்), இது மாதிரி பிரித்தெடுக்க பயன்படுத்தப்படும்,இந்த கரைசலை 1 மாதத்திற்கு 4℃ இல் சேமிக்கலாம்.
தீர்வு3: தீர்வு கழுவவும்
1:19 என்ற அளவு விகிதத்தில் 20× செறிவூட்டப்பட்ட கழுவும் கரைசலை டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட தண்ணீருடன் நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்.எ.கா. 5மிலி 20×வாஷ் கரைசல் + 95மிலி டீயோனைஸ்டு நீர்), இது தட்டுகளைக் கழுவுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும்.இந்த கரைசலை 4℃ வெப்பநிலையில் 1 மாதம் சேமிக்கலாம்.
8. மாதிரி தயாரிப்புகள்
8.1 செயல்பாட்டிற்கு முன் எச்சரிக்கை மற்றும் முன்னெச்சரிக்கைகள்:
(அ) பரிசோதனையின் செயல்பாட்டில், தயவு செய்து ஒரு முறை உதவிக்குறிப்புகளைப் பயன்படுத்தவும், மேலும் வெவ்வேறு மறுஉருவாக்கத்தை உறிஞ்சும் போது உதவிக்குறிப்புகளை மாற்றவும்.
(ஆ) அனைத்து கருவிகளும் சுத்தமாக இருப்பதை உறுதி செய்யவும்.
(இ) திசு மாதிரியை உறைநிலையில் வைக்கவும்.
(ஈ) தயாரிக்கப்பட்ட மாதிரி ஒரே நேரத்தில் மதிப்பீட்டிற்குப் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்.
8.2 விலங்கு திசு (கோழி, பன்றி இறைச்சி போன்றவை)
----ஒத்திசைப்பான் மூலம் மாதிரியை ஒரே மாதிரியாக்கு;
----50மிலி பாலிஸ்டிரீன் மையவிலக்குக் குழாயில் 2.0±0.05 கிராம் ஹோமோஜெனேட்டை எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்;0.2M PB இன் 2ml சேர்க்கவும் (தீர்வு1) , கரைக்க குலுக்கி, பின்னர் 8 மிலி எத்தில் அசிடேட் சேர்த்து 3 நிமிடம் கடுமையாக குலுக்கவும்;
---- பிரிப்பதற்கான மையவிலக்கு: 3000 கிராம் / சுற்றுப்புற வெப்பநிலை / 5 நிமிடம்.
----நைட்ரஜன் வாயு நீரோட்டத்தின் கீழ் 50-60℃ நீர் குளியல் மூலம் உலர்த்தி, 4 மில்லி சூப்பர்நேட்டன்ட் ஆர்கானிக் கட்டத்தை 10 மில்லி கண்ணாடிக் குழாயில் மாற்றவும்;
---- உலர்ந்த எஞ்சியவற்றை 1 மில்லி என்-ஹெக்ஸேன் கொண்டு கரைக்கவும், 30 வினாடிகளுக்கு சுழல் கரைக்கவும், பின்னர் 1 மில்லி பிரித்தெடுத்தல் கரைசலை சேர்க்கவும் (தீர்வு2), 1 நிமிடத்திற்கு சுழல்.பிரிப்பதற்கான மையவிலக்கு: 3000 கிராம் / சுற்றுப்புற வெப்பநிலை / 5 நிமிடம்
---- சூப்பர்நேட்டன்ட் என்-ஹெக்ஸேன் கட்டத்தை அகற்று;50μl அடி மூலக்கூறு நீர்நிலையை மதிப்பீட்டிற்கு எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்.
நீர்த்த காரணி: 1
8.2 பால்
----100μl மூலப் பால் மாதிரியை எடுத்து, 900μl பிரித்தெடுத்தல் கரைசலுடன் கலக்கவும் (தீர்வு2), மற்றும் முழுமையாக கலக்கவும்.
----மதிப்பீட்டிற்காக தயாரிக்கப்பட்ட கரைசலில் 50μl எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்.
நீர்த்த காரணி: 10
9. மதிப்பீட்டு செயல்முறை
9.1 மதிப்பீட்டிற்கு முன் கவனிக்கவும்
9.1.1அனைத்து உலைகளும் மைக்ரோவெல்களும் அறை வெப்பநிலையில் (20-25℃) இருப்பதை உறுதி செய்து கொள்ளவும்.
9.1.2மீதமுள்ள அனைத்து எதிர்வினைகளையும் 2-8 க்கு திருப்பி விடுங்கள்℃பயன்படுத்திய உடனேயே.
9.1.3மைக்ரோவெல்களை சரியாகக் கழுவுவது மதிப்பீட்டின் செயல்பாட்டில் ஒரு முக்கியமான படியாகும்;இது ELISA பகுப்பாய்வின் மறுஉருவாக்கத்திற்கு முக்கிய காரணியாகும்.
9.1.4 ஏஒளியை நீக்கி, அடைகாக்கும் போது மைக்ரோவெல்களை மூடவும்.
9.2 மதிப்பீடு படிகள்
9.2.1 அறை வெப்பநிலையில் (20-25℃) 30 நிமிடங்களுக்கு மேல் அனைத்து வினைகளையும் எடுத்து, பயன்படுத்துவதற்கு முன் மெதுவாக குலுக்கவும்.
9.2.2 தேவையான மைக்ரோவெல்களை வெளியே எடுத்து, மீதமுள்ளவற்றை 2-8℃ இல் உடனடியாக ஜிப்-லாக் பையில் திருப்பி விடுங்கள்.
9.2.3 நீர்த்த வாஷ் கரைசலை பயன்படுத்துவதற்கு முன் அறை வெப்பநிலையில் இருக்கும்படி மீண்டும் சூடாக்க வேண்டும்.
9.2.4எண்:ஒவ்வொரு மைக்ரோவெல் நிலைகளையும் எண்ணி அனைத்து தரநிலைகள் மற்றும் மாதிரிகள் நகலில் இயக்கப்பட வேண்டும்.தரநிலைகள் மற்றும் மாதிரிகள் நிலைகளை பதிவு செய்யவும்.
9.2.5Add நிலையான தீர்வு/மாதிரி மற்றும் ஆன்டிபாடி தீர்வு: 50µl நிலையான தீர்வைச் சேர்க்கவும் ((கிட் வழங்கப்பட்டது)) அல்லது தொடர்புடைய கிணறுகளுக்கு தயாரிக்கப்பட்ட மாதிரி.50µl ஆன்டிபாடி கரைசலை சேர்க்கவும் (கிட் வழங்கப்பட்டது)தட்டை கைமுறையாக அசைப்பதன் மூலம் மெதுவாகக் கலந்து, மூடியுடன் 37℃ 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும்.
9.2.6கழுவுதல்: மூடியை மெதுவாக அகற்றி, கிணறுகளில் இருந்து திரவத்தை சுத்தப்படுத்தி, மைக்ரோவெல்களை 250µl நீர்த்த வாஷ் கரைசலில் துவைக்கவும் (தீர்வு3) 10 வினாடிகள் இடைவெளியில் 4-5 முறை.எஞ்சியிருக்கும் தண்ணீரை உறிஞ்சக்கூடிய காகிதத்துடன் உறிஞ்சவும் (மீதமுள்ள காற்று குமிழியை பயன்படுத்தாத முனையுடன் அகற்றலாம்).
9.2.7என்சைம் கன்ஜுகேட்டைச் சேர்க்கவும்: 100மிலி என்சைம் கான்ஜுகேட் கரைசலை சேர்க்கவும்(கிட் வழங்கப்பட்டது) ஒவ்வொரு கிணற்றிலும், மெதுவாகக் கலந்து, 37 டிகிரியில் 30 நிமிடங்களுக்கு மூடியுடன் அடைகாக்கவும்.கழுவும் படியை மீண்டும் செய்யவும்.
9.2.8வண்ணமயமாக்கல்: 50µl கரைசல் A(கிட் வழங்கப்பட்டது) மற்றும் 50µl கரைசல் B(கிட் வழங்கப்பட்டது) ஒவ்வொரு கிணற்றுக்கும்.மெதுவாக கலந்து 15 நிமிடங்களுக்கு 37 டிகிரி வெப்பநிலையில் மூடி வைக்கவும்.
9.2.9அளவிடவும்: 50µl நிறுத்த கரைசலை சேர்க்கவும்(கிட் வழங்கப்பட்டது) ஒவ்வொரு கிணற்றுக்கும்.மெதுவாக கலந்து 450nm இல் உறிஞ்சுதலை அளவிடவும் (இது 450/630nm என்ற இரட்டை அலைநீளத்துடன் அளவிட பரிந்துரைக்கப்படுகிறது. ஸ்டாப் கரைசலைச் சேர்த்த பிறகு 5 நிமிடத்திற்குள் முடிவைப் படிக்கவும்).
10. முடிவுகள்
10.1 சதவீதம் உறிஞ்சுதல்
தரநிலைகள் மற்றும் மாதிரிகளுக்கு பெறப்பட்ட உறிஞ்சுதல் மதிப்புகளின் சராசரி மதிப்புகள் முதல் தரநிலையின் (பூஜ்ஜிய தரநிலை) உறிஞ்சுதல் மதிப்பால் வகுக்கப்படுகின்றன மற்றும் 100% ஆல் பெருக்கப்படுகின்றன.பூஜ்ஜிய தரநிலையானது 100% க்கு சமமாக செய்யப்படுகிறது மற்றும் உறிஞ்சுதல் மதிப்புகள் சதவீதங்களில் மேற்கோள் காட்டப்படுகின்றன.
B
உறிஞ்சுதல் (%) = —— × 100%
B0
B ——உறிஞ்சும் தரநிலை (அல்லது மாதிரி)
B0 ——உறிஞ்சுதல் பூஜ்ஜிய தரநிலை
10.2 நிலையான வளைவு
----ஒரு நிலையான வளைவை வரைய: தரங்களின் உறிஞ்சுதல் மதிப்பை y-அச்சு, செமி மடக்கை டைலோசின் தரநிலைக் கரைசலின் (பிபிபி) செறிவு x-அச்சாக எடுத்துக்கொள்ளவும்.
----ஒவ்வொரு மாதிரியின் (பிபிபி) டைலோசின் செறிவு, அளவுத்திருத்த வளைவிலிருந்து படிக்கக்கூடியது, பின்பற்றப்படும் ஒவ்வொரு மாதிரியின் தொடர்புடைய நீர்த்த காரணியால் பெருக்கப்படுகிறது, மேலும் மாதிரியின் உண்மையான செறிவு பெறப்படுகிறது.
தயவுசெய்து கவனிக்கவும்:
தரவு பகுப்பாய்வுக்காக சிறப்பு மென்பொருள் உருவாக்கப்பட்டுள்ளது, இது கோரிக்கையின் பேரில் வழங்கப்படலாம்.
11. உணர்திறன், துல்லியம் மற்றும் துல்லியம்
சோதனை உணர்திறன்:1.5 பிபிபி
கண்டறிதல் வரம்பு:
விலங்கு திசு …………………………………………… 1.5 பிபிபி பால் ………………………………………………… 15 பிபிபி துல்லியம்:
விலங்கு திசு ………………………………… 80 ± 15%
பால் ………………………………………………… 80 ± 10%
துல்லியம்:
ELISA கிட்டின் மாறுபாடு குணகம் 10% க்கும் குறைவாக உள்ளது.
12. கவனிக்கவும்
12.1 வினைப்பொருட்கள் மற்றும் மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில் (20-25℃) ஒழுங்குபடுத்தப்படாவிட்டால், தரநிலைகள் மற்றும் மாதிரிகளுக்கு பெறப்பட்ட உறிஞ்சுதல் மதிப்புகளின் சராசரி மதிப்புகள் குறைக்கப்படும்.
12.2 தோல்வியுற்ற மறுஉற்பத்தியைத் தவிர்க்க படிகளுக்கு இடையில் மைக்ரோவெல்கள் உலர அனுமதிக்காதீர்கள் மற்றும் மைக்ரோவெல்ஸ் ஹோல்டரைத் தட்டிய உடனேயே அடுத்த படியை இயக்கவும்.
12.3 பயன்பாட்டிற்கு முன் ஒவ்வொரு மறுஉருவாக்கத்தையும் மெதுவாக அசைக்கவும்.
12.4 உங்கள் தோலை நிறுத்தும் கரைசலில் இருந்து விலக்கி வைக்கவும், அது 0.5MH ஆகும்2SO4தீர்வு.
12.5 காலாவதியான கருவிகளைப் பயன்படுத்த வேண்டாம்.வெவ்வேறு தொகுதிகளின் எதிர்வினைகளை மாற்ற வேண்டாம், இல்லையெனில் அது உணர்திறனைக் குறைக்கும்.
12.6 ELISA கருவிகளை 2-8℃ இல் வைத்திருங்கள், உறைய வைக்க வேண்டாம்.மைக்ரோவெல் தகடுகளுக்கு சீல் வைக்கவும், அனைத்து அடைகாக்கும் போது நேராக சூரிய ஒளியைத் தவிர்க்கவும்.மைக்ரோடிட்டர் தட்டுகளை மூடுவது பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
12.7 அடி மூலக்கூறு கரைசல் நிறமாக மாறினால் கைவிடப்பட வேண்டும்.பூஜ்ஜிய தரநிலையின் உறிஞ்சுதல் மதிப்பு (450/630nm) 0.5 (A450nm<0.5) க்கும் குறைவாக இருந்தால் எதிர்வினைகள் மோசமாக இருக்கலாம்.
12.8 தீர்வு A மற்றும் கரைசல் B ஆகியவற்றைச் சேர்த்த பிறகு வண்ணமயமாக்கல் எதிர்வினைக்கு 15 நிமிடம் தேவைப்படுகிறது. மேலும் நிறம் தீர்மானிக்க முடியாத அளவுக்கு இலகுவாக இருந்தால், அடைகாக்கும் நேர வரம்புகளை 20 நிமிடம் அல்லது அதற்கும் அதிகமாக நீடிக்கலாம்.30 நிமிடங்களுக்கு மேல் இருக்கக்கூடாது, மாறாக, அடைகாக்கும் நேரத்தை சரியாகக் குறைக்கவும்.
12.9 உகந்த எதிர்வினை வெப்பநிலை 37℃.அதிக அல்லது குறைந்த வெப்பநிலை உணர்திறன் மற்றும் உறிஞ்சுதல் மதிப்புகளில் மாற்றங்களுக்கு வழிவகுக்கும்.
13. சேமிப்பு
சேமிப்பு நிலை: 2-8℃.
சேமிப்பு காலம்: 12 மாதங்கள்.
