Komplet kompetitivnih enzimskih imunoanaliza za kvantitativnu analizu tilozina
Komplet za kompetitivni enzimski imunoesej za
Kvantitativna analizaTilozin
1. Pozadina
Tilozinje makrolidni antibiotik koji se uglavnom primjenjuje kao antibakterijski i antimikoplazmatični.Utvrđene su stroge MRL jer ovaj lijek može dovesti do ozbiljnih nuspojava u određenim grupama.
Ovaj komplet je novi proizvod baziran na ELISA tehnologiji, koji je brz, lak, precizan i osjetljiv u poređenju sa uobičajenom instrumentalnom analizom i treba mu samo 1,5 sat u jednoj operaciji, što može značajno smanjiti greške u radu i intenzitet rada.
2. Princip testiranja
Ovaj komplet je baziran na indirektno-kompetitivnoj ELISA tehnologiji.Jažice za mikrotitar su obložene kupložnim antigenom.Ostatak tilozina u uzorku se takmiči sa antigenom obloženim na mikrotitarskoj ploči za antitijelo.Nakon dodavanja enzimom označenog anti-antitijela, TMB supstrat se koristi za prikaz boje.Apsorbanca uzorka je negativno povezana sa tilozinom koji se nalazi u njemu, nakon poređenja sa standardnom krivom, pomnoženom faktorom razblaženja, može se izračunati količina ostatka tilozina u uzorku.
3. Prijave
Ovaj komplet se može koristiti u kvantitativnoj i kvalitativnoj analizi ostataka tilozina u životinjskom tkivu (piletina, svinjetina, patka) i mlijeku, medu, jajima itd.
4. Unakrsne reakcije
Tilozin…………………………………………………………..100%
Tilmikozin…………………………………………………………<2%
5. Potrebni materijali
5.1 Oprema:
---- Spektrofotometar mikrotitarske ploče (450nm/630nm)
----Rotacijski isparivač ili instrumenti za sušenje dušika
----homogenizator
----Shaker
----Centrifuga
----Analitička vaga (induktivnost: 0,01g)
----Gradirana pipeta: 10ml
----Gumena sijalica za pipetu
----Vulumetrijska boca: 10 ml
----Cijevi za centrifugiranje od polistirena: 50ml
----Mikropipete: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multippeta
5.2 Reagensi:
----Natrijum hidroksid (NaOH, AR)
----Natrijum bikarbonat (NaHCO3,AR)
---- Natrijum karbonat (NaCO3, AR)
----Trihlorosirćetna kiselina (AR)
---- acetonitril (AR)
----Etil acetat (AR)
┅┅n-heksan (AR)
----Dejonizovana voda
6. Komponente kompleta
l Mikrotitarska ploča sa 96 jažica obloženih antigenom
l Standardni rastvori (5 boca, 1ml/boca)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Standardna kontrola špicanja: (1ml/boca)1ppm
l Enzimski konjugat 1ml……………..…..…crveni poklopac
l Rastvor antitela 7ml……………….……zelena kapa
l Rastvor A 7ml…………………….….……bijeli poklopac
l Rastvor B 7ml…………………………………………..crveni poklopac
l Stop rastvor 7ml.……………….……….žuti poklopac
l 20×koncentrovani rastvor za pranje 40ml
……………………………………………..…prozirna kapa
l 4×koncentrovani rastvor za ekstrakciju 50ml
………………………………………………………….plava kapa
7. Priprema reagensa:
Rješenje 1:0,1 mol/L rastvora NaOH
Odvažite 0,4 g NaOH u 100 ml dejonizirane vode i potpuno promiješajte.
Rješenje 2: 1mol/L rastvora NaOH
Izvagajte 4 g NaOH u 100 ml deionizirane vode i potpuno promiješajte.
Rješenje 3: karbonatna pufer sol
Rješenje1: 0,2M PB
Otopiti 51,6 g Na2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O sa dejonizovanom vodom i razblažite do 1000 ml.
Rješenje2: Rešenje za ekstrakciju
Razrijedite 2×koncentrirani rastvor za ekstrakciju dejoniziranom vodom u volumnom omjeru 1:1(npr. 10ml rastvora 2×ekstrakcije + 10ml dejonizovane vode), koji će se koristiti za ekstrakciju uzoraka,ovaj rastvor se može čuvati na 4℃ 1 mesec.
Rješenje3: Rastvor za pranje
Razblažite 20×koncentrovani rastvor za pranje dejonizovanom vodom u volumnom omjeru 1:19(npr. 5 ml rastvora za 20×pranje + 95 ml dejonizovane vode), koji će se koristiti za pranje ploča.Ovaj rastvor se može čuvati na 4℃ 1 mesec.
8. Priprema uzoraka
8.1 Obavijesti i mjere opreza prije rada:
(a) Koristite jednokratne vrhove u procesu eksperimenta i promijenite vrhove kada apsorbirate drugačiji reagens.
(b) Uvjerite se da su svi instrumenti čisti.
(c) Držite uzorak tkiva u zamrznutom stanju.
(d) Pripremljeni uzorak treba odmah koristiti za analizu.
8.2 Životinjsko tkivo (piletina, svinjetina, itd.)
----Homogenizirati uzorak pomoću homogenizatora;
----Uzmite 2,0±0,05 g homogenata u epruvetu za centrifugiranje od polistirena od 50 ml;dodati 2ml 0,2M PB (rješenje1) protresite da se rastvori, a zatim dodajte 8 ml etil acetata i snažno mućkajte 3 min;
----Centrifuga za odvajanje: 3000g / temperatura okoline / 5min.
----Prenesite 4ml organske faze supernatanta u staklenu epruvetu od 10ml, osušite u vodenom kupatilu na 50-60℃ pod strujom gasa azota;
----Otopite suhi ostatak sa 1ml n-heksana, mešajte 30s da se rastvori, a zatim dodajte 1ml rastvora za ekstrakciju (rješenje2), vrtlog 1 min.centrifuga za odvajanje: 3000g / temperatura okoline / 5min
----Ukloniti supernatant n-heksanske faze;uzeti 50 μl vodene faze supstrata za analizu.
Faktor razblaženja: 1
8.2 Mlijeko
----Uzmite 100μl uzorka sirovog mlijeka, pomiješajte sa 900μl otopine za ekstrakciju (rješenje2) i potpuno promiješajte.
----Uzmite 50μl pripremljenog rastvora za analizu.
Faktor razblaženja: 10
9. Proces analize
9.1 Napomena prije analize
9.1.1Uvjerite se da su svi reagensi i mikrojažice na sobnoj temperaturi (20-25℃).
9.1.2Vratite sve ostale reagense na 2-8℃odmah nakon upotrebe.
9.1.3Pravilno pranje mikro-jažica je važan korak u procesu analize;to je vitalni faktor za ponovljivost ELISA analize.
9.1.4 Aispraznite svjetlo i pokrijte mikrojažice tokom inkubacije.
9.2 Koraci analize
9.2.1 Izvadite sve reagense na sobnoj temperaturi (20-25℃) duže od 30 minuta, lagano protresite prije upotrebe.
9.2.2 Izvadite potrebne mikro jažice, a ostatak odmah vratite u vrećicu sa zatvaračem na 2-8 ℃.
9.2.3 Razrijeđeni rastvor za pranje treba ponovo zagrijati da bude na sobnoj temperaturi prije upotrebe.
9.2.4Broj:Numerisana svaka pozicija mikrojažica i svi standardi i uzorci treba da se rade u duplikatu.Zabilježite standarde i položaje uzoraka.
9.2.5Add standardni rastvor/uzorak i rastvor antitela: Dodati 50µl standardnog rastvora((komplet obezbeđen)) ili pripremljenog uzorka u odgovarajuće bunare.Dodati 50 µl rastvora antitela (komplet obezbeđen).Lagano promiješajte ručnim protresanjem ploče i inkubirajte 30 minuta na 37 ℃ sa poklopcem.
9.2.6Oprati: Pažljivo uklonite poklopac i očistite tečnost iz jažica i isperite mikrojažice sa 250 µl razblaženog rastvora za pranje (rješenje3) u intervalu od 10s za 4-5 puta.Apsorbirajte preostalu vodu upijajućim papirom (ostatak mjehurića zraka se može eliminirati neiskorištenim vrhom).
9.2.7Dodajte enzimski konjugat: Dodajte 100 ml rastvora enzimskog konjugata (komplet obezbeđen) u svaku jažicu, lagano promiješajte i inkubirajte 30 minuta na 37℃ sa poklopcem.Ponovite korak pranja ponovo.
9.2.8Coloration: Dodati 50µl rastvora A(komplet obezbeđen) i 50µl otopine B(komplet obezbeđen) na svaki bunar.Lagano promešajte i inkubirajte 15 minuta na 37℃ sa poklopcem.
9.2.9Mjera: Dodajte 50µl stop rastvora (komplet obezbeđen) na svaki bunar.Lagano promiješajte i izmjerite apsorbanciju na 450 nm (predlaže se mjerenje dvostrukom talasnom dužinom od 450/630 nm. Očitajte rezultat u roku od 5 minuta nakon dodavanja stop rastvora).
10. Rezultati
10.1 Procenat apsorpcije
Srednje vrijednosti vrijednosti apsorbancije dobijene za standarde i uzorke podijeljene su vrijednošću apsorbancije prvog standarda (nulti standard) i pomnožene sa 100%.Nulti standard je stoga jednak 100%, a vrijednosti apsorpcije su navedene u procentima.
B
Upijanje (%) = —— ×100%
B0
B ——standard apsorpcije (ili uzorak)
B0 ——standard nulte apsorpcije
10.2 Standardna kriva
----Da biste nacrtali standardnu krivu: Uzmite vrijednost apsorpcije standarda kao y-osu, polulogaritamsku koncentraciju otopine standarda tilozina (ppb) kao x-os.
----Koncentracija tilozina u svakom uzorku (ppb), koja se može očitati iz kalibracione krive, množi se odgovarajućim faktorom razblaženja svakog uzorka koji se prati, i dobija se stvarna koncentracija uzorka.
Molimo primijetite:
razvijen je poseban softver za analizu podataka koji se može obezbediti na zahtev.
11. Osetljivost, tačnost i preciznost
Test osjetljivosti:1.5ppb
Granica detekcije:
Životinjsko tkivo………………………………1.5ppb Mlijeko……………………………………………………………………..15ppb tačnost:
Životinjsko tkivo……………………………………80±15%
Mlijeko……………………………………………..……….……80±10%
Preciznost:
Koeficijent varijacije ELISA kompleta je manji od 10%.
12. Napomena
12.1 Srednje vrijednosti vrijednosti apsorbancije dobijene za standarde i uzorke će se smanjiti ako reagensi i uzorci nisu regulirani na sobnu temperaturu (20-25 ℃).
12.2 Ne dozvolite da se mikrojažice osuše između koraka kako biste izbjegli neuspješnu ponovljivost i pokrenite sljedeći korak odmah nakon dodirivanja držača mikrojažica.
12.3 Prije upotrebe lagano protresti svaki reagens.
12.4 Držite kožu dalje od otopine za zaustavljanje jer je 0,5MH2SO4rješenje.
12.5 Ne koristite komplete zastarjele.Nemojte mijenjati reagense različitih serija, inače će pasti osjetljivost.
12.6 Držite ELISA komplete na 2-8℃, nemojte zamrzavati.Zapečatite mikro jažice za odmor, izbegavajte direktnu sunčevu svetlost tokom svih inkubacija.Preporučuje se pokrivanje mikrotitarskih ploča.
12.7 Rastvor supstrata treba napustiti ako poprimi boju.Reagensi mogu biti loši ako je vrijednost apsorbancije (450/630nm) nulte standarda manja od 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Za reakciju bojenja potrebno je 15 minuta nakon dodavanja otopine A i otopine B. Možete produžiti vrijeme inkubacije na 20 minuta ili više ako je boja presvijetla da bi se odredila.Nikada ne prelazite 30 minuta, naprotiv, skratite vrijeme inkubacije na pravi način.
12.9 Optimalna temperatura reakcije je 37℃.Viša ili niža temperatura će dovesti do promjena vrijednosti osjetljivosti i apsorpcije.
13. Skladištenje
Uvjeti skladištenja: 2-8℃.
Rok skladištenja: 12 mjeseci.
