Twous imunoassay anzim konpetitif pou analiz kantitatif Tylosin
Konpetitif Anzim Imunoessai Twous pou
Kantite analiz deTylosin
1. background
Tylosinse yon antibyotik makrolid, ki se sitou aplike kòm anti-bakteri ak anti-mycoplasma.MRL strik yo te etabli depi dwòg sa a ka mennen nan efè segondè grav nan sèten gwoup.
Twous sa a se yon nouvo pwodwi ki baze sou teknoloji ELISA, ki se rapid, fasil, egzat ak sansib konpare ak analiz enstrimantal komen epi li bezwen sèlman 1.5 èdtan nan yon operasyon, li ka konsiderableman minimize erè operasyon ak entansite travay.
2. Prensip tès
Twous sa a baze sou teknoloji ELISA endirèk-konpetitif.Pwi microtiter yo kouvwi ak antijèn kouple.Tilosin rezidi nan echantiyon an konkirans ak antijèn ki kouvri sou plak mikrotiter la pou antikò a.Apre adisyon a nan anzim ki make anti-antikò, yo itilize substra TMB pou montre koulè a.Se absorpsyon nan echantiyon an negatif ki gen rapò ak tilosin nan abite nan li, apre yo fin konpare ak koub la Creole, miltipliye pa faktè a dilution, kantite rezidi tilosin nan echantiyon an ka kalkile.
3. Aplikasyon
Twous sa a ka itilize nan analiz quantitative ak kalitatif nan rezidi tilosin nan tisi bèt (poul, kochon, kanna) ak lèt, siwo myèl, ze, elatriye.
4. Reyaksyon kwaze
Tylosin………………………………………………………..100%
Tilmicosin……………………………………………………<2%
5. Materyèl ki obligatwa
5.1 Ekipman:
---- Espektrofotomèt plak mikrotitè (450nm/630nm)
----Rotary evaporator oswa enstriman siye nitwojèn
----omojèn
----Shaker
---- Santrifij
---- Balans analitik (induktans: 0.01g)
---- Pipèt gradye: 10ml
----Anpoul pipèt kawotchou
---- Flakon volumetrik: 10ml
---- Tib santrifij polystyrène: 50ml
----Mikwopipèt: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multippèt
5.2 Reyaktif:
----Idwoksid sodyòm (NaOH, AR)
----Bikabonat sodyòm (NaHCO3,AR)
---- Kabonat sodyòm (NaCO3, AR)
---- Asid trikloroaketik (AR)
---- Acetonitrile (AR)
---- Acetate etil (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----Dlo deyonize
6. Twous Eleman
l Plak mikrotiter ak 96 pwi ki kouvri ak antijèn
l Solisyon estanda (5 boutèy, 1ml / boutèy)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking estanda kontwòl: (1ml / boutèy)1 ppm
l Anzim konjige 1ml……………..…..…bouchon wouj
l Antikò solisyon 7ml………………………………bouchon vèt
l Solisyon A 7ml…………………………….……bouchon blan
l Solisyon B 7ml……………………………..bouchon wouj
l Stop solisyon 7ml.…………….……….bouchon jòn
l 20×konsantre lave solisyon 40ml
…………………………………………..…bouchon transparan
l 4×konsantre ekstraksyon solisyon 50ml
……………………………………………………….bouchon ble
7. Preparasyon reyaktif:
Solisyon 1:0.1mol/L NaOH solisyon
Peze 0.4g NaOH a 100ml dlo deyonize epi melanje nèt.
Solisyon 2: 1mol/L NaOH solisyon
Peze 4g NaOH a 100ml dlo deyonize epi melanje nèt.
Solisyon 3: Sèl tanpon kabonat
Solisyon1: 0.2M PB
Fonn 51.6g Na2HPO4·12H2O, 8.7g NaH2PO4·2H2O ak dlo deyonize epi delye nan 1000ml.
Solisyon2: solisyon ekstraksyon
Delye 2 × solisyon ekstraksyon konsantre ak dlo deyonize nan rapò volim 1:1 (eg 10ml nan 2 × solisyon ekstraksyon + 10ml nan dlo deyonize), ki pral itilize pou fè ekstraksyon echantiyon,solisyon sa a ka estoke nan 4 ℃ pou 1 mwa.
Solisyon3: Lave solisyon
Delye 20 × solisyon lave konsantre ak dlo deyonize nan rapò volim 1:19 (eg 5ml 20×lave solisyon + 95ml dlo deyonize), ki pral itilize pou lave plak yo.Solisyon sa a ka estoke nan 4 ℃ pou 1 mwa.
8. Egzanp Preparasyon
8.1 Avi ak prekosyon anvan operasyon:
(a) Tanpri sèvi ak konsèy yon sèl nan pwosesis la nan eksperyans, epi chanje konsèy yo lè absòbe diferan reyaktif.
(b) Asire w ke tout enstriman yo pwòp.
(c) Kenbe echantiyon tisi nan friz.
(d) Yo ta dwe itilize echantiyon prepare pou tès la yon fwa.
8.2 Tisi bèt (poul, vyann kochon, elatriye)
----Omojenize echantiyon an ak omojènize;
----Pran 2.0±0.05g omojene nan yon tib santrifujeur 50ml polystyrène;ajoute 2ml 0.2M PB (solisyon1), souke pou fonn, epi ajoute 8ml acetate etil epi souke fò pou 3min;
---- Santrifij pou separasyon: 3000g / tanperati anbyen / 5min.
----Transfere 4ml faz òganik supernatant nan yon tib an vè 10ml, sèk ak beny dlo 50-60℃ anba kouran gaz nitwojèn;
---- Fonn rès sèk la ak 1ml n-hexane, vortex pou 30s pou fonn, epi ajoute 1ml solisyon ekstraksyon (solisyon2), vortex pou 1min.Santrifij pou separasyon: 3000g / tanperati anbyen / 5min
---- Retire faz n-hexane supernatant la;pran 50μl nan faz akeuz substra a pou analiz.
Faktè dilution: 1
8.2 Lèt
---- Pran 100μl nan echantiyon lèt kri, melanje ak 900μl nan solisyon ekstraksyon (solisyon2), epi melanje nèt.
---- Pran 50μl nan solisyon an prepare pou tès.
Faktè dilution: 10
9. Pwosesis tès
9.1 Avi anvan tès la
9.1.1Asire w ke tout reyaktif ak microwells yo tout nan tanperati chanm (20-25 ℃).
9.1.2Retounen tout rès reyaktif yo nan 2-8℃imedyatman apre yo fin itilize.
9.1.3Lave microwells yo kòrèkteman se yon etap enpòtan nan pwosesis la nan tès;li se faktè ki enpòtan anpil nan repwodiksyon analiz ELISA.
9.1.4 Aanile limyè a epi kouvri microwells yo pandan enkubasyon.
9.2 Etap tès yo
9.2.1 Retire tout reyaktif nan tanperati chanm (20-25 ℃) pou plis pase 30min, souke dousman anvan ou itilize.
9.2.2 Retire mikwo-puits ki nesesè yo epi retounen rès la nan sak zip-lock la nan 2-8 ℃ imedyatman.
9.2.3 Solisyon lave dilye a ta dwe rechofe pou li nan tanperati chanm anvan ou itilize.
9.2.4Nimewo:Nimero chak pozisyon microwell ak tout estanda ak echantiyon yo ta dwe kouri an kopi.Ekri estanda yo ak pozisyon echantiyon yo.
9.2.5Add solisyon estanda / echantiyon ak solisyon antikò: Ajoute 50µl solisyon estanda ((twous yo bay)) oswa echantiyon prepare nan pwi korespondan.Ajoute 50µl solisyon antikò (twous yo bay).Melanje dousman pa souke plak la manyèlman epi enkube pou 30min nan 37 ℃ ak kouvèti.
9.2.6Lave: Retire kouvèti a dousman epi pi likid la soti nan pwi yo epi rense microwell yo ak 250µl solisyon lave dilye (solisyon3) nan entèval 10s pou 4-5 fwa.Absòbe dlo rezidyèl la ak papye absòbe (ti ti wonn lè rès la ka elimine ak pwent ki pa itilize).
9.2.7Ajoute konjige anzim: Ajoute 100ml solisyon konjige anzim (twous yo bay) nan chak pi, melanje dousman epi enkube pou 30min nan 37℃ ak kouvèti.Repete etap lave a ankò.
9.2.8Kolorasyon: Ajoute 50µl solisyon A(twous yo bay) ak 50µl solisyon B(twous yo bay) nan chak pi.Melanje dousman epi enkube pou 15min nan 37 ℃ ak kouvèti.
9.2.9Mezire: Ajoute 50µl nan solisyon an sispann (twous yo bay) nan chak pi.Melanje dousman epi mezire absorpsyon nan 450nm (Li sijere mezire ak longèdonn doub nan 450/630nm. Li rezilta a nan 5min apre yo fin ajoute solisyon sispann).
10. Rezilta
10.1 Pousantaj absòbe
Valè mwayen valè absòbe yo jwenn pou estanda yo ak echantiyon yo divize pa valè absòbe premye estanda a (zewo estanda) epi miltipliye pa 100%.Se estanda zewo a ki egal a 100% ak valè absòbe yo site an pousantaj.
B
Absorbans (%) = —— × 100%
B0
B ——estanda absòpsyon (oswa echantiyon)
B0 ——absòbsyon zewo estanda
10.2 Koub Creole
----Pou trase yon koub estanda: Pran valè absorpsyon estanda yo kòm aks y, semi logaritmik nan konsantrasyon solisyon estanda tylosin (ppb) kòm aks x.
----Konsantrasyon tilosin chak echantiyon (ppb), ki ka li nan koub kalibrasyon an, miltipliye pa faktè Dilution korespondan chak echantiyon ki te swiv, epi yo jwenn konsantrasyon aktyèl echantiyon an.
Tanpri remake:
lojisyèl espesyal yo te devlope pou analiz done, ki ka bay sou demann.
11. Sansiblite, presizyon ak presizyon
Tès Sansiblite:1.5ppb
Limit deteksyon:
Tisi bèt ………………………………………… 1.5ppb Lèt……………………………………………………………………..15ppb Presizyon:
Tisi bèt………………………………………………80±15%
Lèt………………………………………..……….……80±10%
Presizyon:
Varyasyon koyefisyan nan twous ELISA a se mwens pase 10%.
12. Avi
12.1 Valè mwayèn valè absòbe yo jwenn pou estanda yo ak echantiyon yo ap redwi si reyaktif yo ak echantiyon yo pa te reglemante nan tanperati chanm (20-25 ℃).
12.2 Pa kite mikwo-puits yo sèk ant etap pou evite repwodiksyon san siksè epi opere pwochen etap la imedyatman apre tape detantè mikwo-puits la.
12.3 Souke chak reyaktif dousman anvan w itilize.
12.4 Kenbe po ou lwen solisyon stop la paske li se 0.5MH2SO4solisyon.
12.5 Pa sèvi ak twous yo demode.Pa fè echanj reyaktif diferan pakèt, oswa sinon li pral lage sansiblite a.
12.6 Kenbe twous ELISA yo nan 2-8 ℃, pa friz.Sele plak mikwopuit rès yo, Evite limyè solèy la dwat pandan tout enkubasyon yo.Li rekòmande kouvri plak mikrotiter yo.
12.7 Yo ta dwe abandone solisyon substrate si li vire koulè.Réactifs yo ka tounen move si valè absorbance (450/630nm) estanda zewo a mwens ke 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 Reyaksyon kolorasyon an bezwen 15min apre adisyon solisyon A ak solisyon B. Epi ou ka pwolonje ranje tan enkubasyon a 20min oswa plis si koulè a twò limyè pou detèmine.Pa janm depase 30min, okontrè, diminye tan enkubasyon an byen.
12.9 Tanperati reyaksyon optimal se 37℃.Tanperati ki pi wo oswa pi ba ap mennen nan chanjman nan valè sansiblite ak absòbe.
13. Depo
Kondisyon depo: 2-8 ℃.
Peryòd depo: 12 mwa.
