Набор для конкурентного иммуноферментного анализа для количественного анализа тилозина
Набор для конкурентного иммуноферментного анализа
Количественный анализТилозин
1. Фон
Тилозинявляется макролидным антибиотиком, который в основном применяется как антибактериальное и противомикоплазменное средство.Были установлены строгие MRL, поскольку этот препарат может вызывать серьезные побочные эффекты в определенных группах.
Этот набор представляет собой новый продукт, основанный на технологии ELISA, который является быстрым, простым, точным и чувствительным по сравнению с обычным инструментальным анализом и требует всего 1,5 часа на одну операцию, что может значительно минимизировать погрешность операции и интенсивность работы.
2. Принцип тестирования
Этот набор основан на технологии непрямого конкурентного ИФА.Лунки микротитровального аппарата покрыты связывающим антигеном.Остаток тилозина в образце конкурирует с антигеном, нанесенным на планшет для микротитрования, за антитело.После добавления меченого ферментом анти-антитела для проявления цвета используют субстрат ТМБ.Поглощение образца отрицательно связано с содержанием в нем тилозина, после сравнения со стандартной кривой, умноженной на коэффициент разбавления, можно рассчитать количество остатка тилозина в образце.
3. Приложения
Этот набор можно использовать для количественного и качественного анализа остатка тилозина в тканях животных (курица, свинина, утка), а также в молоке, меде, яйцах и т. д.
4. Перекрестные реакции
Тилозин…………………………………………………..100%
Тилмикозин…………………………………………………<2%
5. Необходимые материалы
5.1 Оборудование:
---- Спектрофотометр для микротитровальных планшетов (450 нм/630 нм)
----Роторный испаритель или инструменты для сушки азотом
---- гомогенизатор
---- Шейкер
---- Центрифуга
---- Аналитические весы (индуктивность: 0,01 г)
---- Градуированная пипетка: 10 мл
---- Резиновая груша для пипетки
---- Объемная колба: 10 мл
---- полистироловые центрифужные пробирки: 50 мл
----Микропипетки: 20-200мл, 100-1000мл
250мл-мультипипетка
5.2 Реагенты:
----Гидроксид натрия (NaOH, AR)
---- Бикарбонат натрия (NaHCO3,АР)
---- Карбонат натрия (NaCO3, АР)
---- Трихлоруксусная кислота (АР)
---- Ацетонитрил (АР)
----Этилацетат (АР)
┅┅н-гексан (AR)
----Деионизированная вода
6. Компоненты комплекта
l Планшет для микротитрования с 96 лунками, покрытыми антигеном
l Стандартные растворы (5 бутылок, 1 мл/бутылка)
0 частей на миллиард, 0,5 частей на миллиард, 1,5 частей на миллиард, 4,5 частей на миллиард, 13,5 частей на миллиард
l Стандартный контроль добавления: (1 мл/бутылка)1 часть на миллион
л Ферментный конъюгат 1мл……………..…..…красная крышка
l Раствор антител 7 мл……………….……зеленая крышка
л Раствор А 7мл…………………….….……белый колпачок
л Раствор B 7мл...………………………………..красная крышка
л Стоп-раствор 7 мл.……………….……….желтая крышка
л 20×концентрированный промывочный раствор 40мл
……………………………………..…прозрачная крышка
л 4 × концентрированный экстракционный раствор 50 мл
………………………………………………….синяя крышка
7. Подготовка реагентов:
Решение 1:0,1 моль/л раствор NaOH
Взвесьте 0,4 г NaOH в 100 мл деионизированной воды и полностью перемешайте.
Решение 2: 1 моль/л раствор NaOH
Взвесьте 4 г NaOH в 100 мл деионизированной воды и полностью перемешайте.
Решение 3: Карбонатная буферная соль.
Решение1: 0,2 МпБ
Растворить 51,6 г Na2ГПО4·12 часов2O, 8,7 г NaH2PO4·2ч2O деионизированной водой и разбавить до 1000 мл.
Решение2: Экстракционный раствор
Разбавьте 2-кратный концентрированный экстракционный раствор деионизированной водой в объемном соотношении 1:1 (например, 10 мл 2-кратного экстрагирующего раствора + 10 мл деионизированной воды), который будет использоваться для извлечения образца,этот раствор можно хранить при температуре 4 ℃ в течение 1 месяца..
Решение3: Промывочный раствор
Разбавьте 20-кратный концентрированный промывочный раствор деионизированной водой в объемном соотношении 1:19 (например, 5 мл 20-кратного промывочного раствора + 95 мл деионизированной воды), который будет использоваться для мытья тарелок.Этот раствор можно хранить при температуре 4 ℃ в течение 1 месяца..
8. Подготовка образцов
8.1 Уведомление и меры предосторожности перед эксплуатацией:
(a) Пожалуйста, используйте одноразовые наконечники в процессе эксперимента и меняйте наконечники при абсорбции другого реагента.
(b) Убедитесь, что все инструменты чистые.
(c) Храните образец ткани в замороженном состоянии.
(d) Приготовленный образец следует использовать для анализа сразу.
8.2 Ткани животных (курица, свинина и т. д.)
----Гомогенизируйте образец гомогенизатором;
---- Возьмите 2,0 ± 0,05 г гомогената в полистироловую центрифужную пробирку объемом 50 мл;добавить 2 мл 0,2 М ФБ (решение1) встряхните до полного растворения, затем добавьте 8 мл этилацетата и энергично встряхивайте в течение 3 минут;
---- Центрифуга для разделения: 3000 г / температура окружающей среды / 5 мин.
---- Перенесите 4 мл супернатанта органической фазы в стеклянную пробирку объемом 10 мл, высушите на водяной бане при 50-60 ℃ в потоке азота;
---- Растворите сухой остаток в 1 мл н-гексана, встряхивайте в течение 30 с для растворения, а затем добавьте 1 мл экстракционного раствора (решение2), вортекс в течение 1 мин.центрифуга для разделения: 3000 г / температура окружающей среды / 5 мин.
---- Удалить надосадочную фазу н-гексана;взять 50 мкл водной фазы субстрата для анализа.
Коэффициент разбавления: 1
8.2 Молоко
---- Возьмите 100 мкл образца сырого молока, смешайте с 900 мкл экстракционного раствора (решение2) и полностью перемешать.
---- Возьмите 50 мкл приготовленного раствора для анализа.
Коэффициент разбавления: 10
9. Процесс анализа
9.1 Уведомление перед анализом
9.1.1Убедитесь, что все реагенты и микролунки имеют комнатную температуру (20-25 ℃).
9.1.2Вернуть все остальные реагенты на 2-8℃сразу после использования.
9.1.3Правильная промывка микролунок является важным этапом в процессе анализа;это жизненно важный фактор для воспроизводимости анализа ELISA.
9.1.4 Авыключите свет и накройте микролунки во время инкубации.
9.2 Этапы анализа
9.2.1 Выдержите все реагенты при комнатной температуре (20-25°С) более 30 минут, осторожно встряхните перед использованием.
9.2.2 Достаньте необходимые микролунки и немедленно положите остальные в пакет с застежкой-молнией при температуре 2-8℃.
9.2.3 Перед использованием разбавленный промывочный раствор следует подогреть до комнатной температуры.
9.2.4Число:Каждая позиция микролунки пронумерована, а все стандарты и образцы должны быть проанализированы в двух экземплярах.Запишите положения стандартов и образцов.
9.2.5Add стандартный раствор/образец и раствор антител: Добавьте 50 мкл стандартного раствора((предоставленный комплект)) или подготовленный образец в соответствующие лунки.Добавьте 50 мкл раствора антител (предоставленный комплект).Аккуратно перемешайте, встряхивая планшет вручную, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 ℃ под крышкой.
9.2.6Стирать: Аккуратно снимите крышку, удалите жидкость из лунок и промойте микролунки 250 мкл разбавленного промывочного раствора (решение3) с интервалом 10 с 4-5 раз.Соберите оставшуюся воду впитывающей бумагой (остатки пузырьков воздуха можно удалить с помощью неиспользованного наконечника).
9.2.7Добавить ферментный конъюгат: Добавьте 100 мл раствора ферментного конъюгата (предоставленный комплект) в каждую лунку, осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 30 минут при 37 ℃ под крышкой.Повторите этап стирки еще раз.
9.2.8Окраска: Добавьте 50 мкл раствора А(предоставленный комплект) и 50 мкл раствора B(предоставленный комплект) в каждую лунку.Аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 15 минут при 37 ℃ под крышкой.
9.2.9Мера: Добавьте 50 мкл стоп-раствора (предоставленный комплект) в каждую лунку.Аккуратно перемешайте и измерьте поглощение при 450 нм (рекомендуется измерять с двойной длиной волны 450/630 нм. Прочитайте результат в течение 5 минут после добавления стоп-раствора).
10. Результаты
10.1 Процент поглощения
Средние значения значений абсорбции, полученные для стандартов и образцов, делят на значение абсорбции первого стандарта (нулевой стандарт) и умножают на 100%.Таким образом, нулевой стандарт принимается равным 100%, а значения абсорбции приводятся в процентах.
B
Поглощение (%) = —— ×100%
B0
B — стандарт поглощения (или образец)
B0 — нулевой стандарт поглощения
10.2 Стандартная кривая
----Чтобы нарисовать стандартную кривую: возьмите значение абсорбции стандартов по оси ординат, полулогарифм концентрации раствора стандартов тилозина (млрд) по оси абсцисс.
---- Концентрация тилозина в каждом образце (частей на миллиард), которую можно считать по калибровочной кривой, умножается на соответствующий коэффициент разбавления каждого последующего образца, и получается фактическая концентрация образца.
Пожалуйста отметьте:
для анализа данных разработано специальное программное обеспечение, которое может быть предоставлено по запросу.
11. Чувствительность, точность и прецизионность
Чувствительность теста:1,5 частей на миллиард
Предел обнаружения:
Ткани животных…………………………….……………1,5 частей на миллиард Молоко………………………………………………………..15ppb Точность:
Ткани животных…………………………………………80±15%
Молоко……………………………………..……….……80±10%
Точность:
Коэффициент вариации набора ИФА менее 10%.
12. Уведомление
12.1 Средние значения коэффициентов поглощения, полученные для стандартов и образцов, будут снижены, если реагенты и образцы не были отрегулированы до комнатной температуры (20-25°С).
12.2 Не допускайте высыхания микролунок между этапами во избежание неудачной воспроизводимости и переходите к следующему этапу сразу же после постукивания по держателю микропланшетов.
12.3 Осторожно встряхните каждый реагент перед использованием.
12.4 Держите кожу подальше от стоп-раствора, так как он содержит 0,5 МН.2SO4решение.
12.5 Не используйте просроченные комплекты.Не меняйте реагенты разных партий, иначе чувствительность снизится.
12.6 Храните наборы ELISA при температуре 2-8°С, не замораживайте.Запечатайте остальные микролуночные планшеты. Избегайте прямых солнечных лучей во время всех инкубаций.Рекомендуется накрывать планшеты для микротитрования.
12.7 От раствора субстрата следует отказаться, если он изменил цвет.Реагенты могут испортиться, если значение поглощения (450/630 нм) нулевого стандарта меньше 0,5 (А450 нм <0,5).
12.8 Реакция окрашивания требует 15 минут после добавления раствора А и раствора В. И вы можете увеличить время инкубации до 20 минут или более, если цвет слишком светлый, чтобы его можно было определить.Никогда не превышайте 30 минут, наоборот, сократите время инкубации должным образом.
12.9 Оптимальная температура реакции составляет 37℃.Более высокая или более низкая температура приведет к изменению значений чувствительности и оптической плотности.
13. Хранение
Условия хранения: 2-8℃.
Срок хранения: 12 месяцев.
