تىلوسىننىڭ مىقدار ئانالىزى ئۈچۈن رىقابەتچان ئېنزىم ئىممۇنىتېت زاپچىسى
رىقابەت كۈچىگە ئىگە ئېنزىم ئىممۇنىتېت زاپچاسلىرى
مىقدار ئانالىزىTylosin
1. ئارقا كۆرۈنۈش
Tylosinماكرولىد ئانتىبىئوتىك بولۇپ ، ئاساسلىقى باكتېرىيەگە قارشى تۇرۇش ۋە مىكوپلازماغا قارشى ئىشلىتىلىدۇ.بۇ دورا بەزى گۇرۇپپىلاردا ئېغىر ئەگەشمە كېسەللىكلەرنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن بولغاچقا ، قاتتىق MRL قۇرۇلدى.
بۇ يۈرۈشلۈك ELISA تېخنىكىسىنى ئاساس قىلغان يېڭى مەھسۇلات بولۇپ ، ئادەتتىكى ئەسۋاب ئانالىزىغا سېلىشتۇرغاندا تېز ، ئاسان ، توغرا ۋە سەزگۈر بولۇپ ، بىر مەشغۇلاتتا پەقەت 1.5 سائەتلا ۋاقىت كېتىدۇ ، ئۇ مەشغۇلات خاتالىقى ۋە خىزمەت سالمىقىنى زور دەرىجىدە تۆۋەنلىتىدۇ.
2. سىناق پرىنسىپى
بۇ يۈرۈشلۈك ۋاسىتىلىك رىقابەت كۈچىگە ئىگە ELISA تېخنىكىسىنى ئاساس قىلغان.مىكرو قۇدۇق قۇدۇقلىرى بىرىكتۈرۈلگەن ئانتىگېن بىلەن سىرلانغان.ئەۋرىشكىدىكى تىلوسىن قالدۇقى ئانتىتېلا ئۈچۈن مىكرو تىپلىق تەخسىگە سىرلانغان ئانتىگېن بىلەن رىقابەتلىشىدۇ.ئانتىتېلاغا قارشى بەلگە قويۇلغان ئېنزىم قوشۇلغاندىن كېيىن ، TMB تارماق ئېلېمېنتى رەڭنى كۆرسىتىشكە ئىشلىتىلىدۇ.ئەۋرىشكىنىڭ سۈمۈرۈلۈشى ئۇنىڭدىكى تىلوسىننىڭ مەنپىي بولۇشى بىلەن سەلبىي مۇناسىۋەتلىك ، ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق بىلەن سېلىشتۇرغاندىن كېيىن ، سۇيۇلۇش ئامىلى بىلەن كۆپەيتىلگەندىن كېيىن ، ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى تىلوسىن قالدۇق مىقدارىنى ھېسابلىغىلى بولىدۇ.
3. قوللىنىشچان پروگراممىلار
بۇ زاپچاسنى ھايۋانات توقۇلمىلىرى (توخۇ ، چوشقا گۆشى ، ئۆردەك) ۋە سۈت ، ھەسەل ، تۇخۇم قاتارلىقلاردىكى تىلوسىن قالدۇقىنى مىقدار ۋە سۈپەتلىك تەھلىل قىلىشقا ئىشلىتىشكە بولىدۇ.
4. ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش
تىلوسىن ……………………………………………… ..100%
تىلمىكوسىن ……………………………………………… <2%
5. تەلەپ قىلىنغان ماتېرىياللار
5.1 ئۈسكۈنىلەر:
---- مىكرو تىپلىق تەخسە سپېكترو فوتومېتىر (450nm / 630nm)
---- ئايلانما پارغا ئايلاندۇرغۇچ ياكى ئازوت قۇرۇتۇش ئەسۋابى
---- homogenizer
---- Shaker
---- Centrifuge
---- ئانالىز تەڭپۇڭلۇقى (ئىندۇكسىيە: 0.01g)
---- ئوقۇش پۈتتۈرگەن تۇرۇبا: 10ml
---- كاۋچۇك تۇرۇبا لامپۇچكىسى
---- ھەجىمدىكى چاقماق لامپا: 10ml
---- پولىستىرېن مەركەزدىن ياسالغان تۇرۇبا: 50ml
---- Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml- كۆپ ئىقتىدارلىق
5.2 رېئاكتور:
----ناترىي ھىدروكسىد (NaOH, AR)
---- ناترىي ئىككى كاربونات (NaHCO)3,AR)
---- ناترىي كاربونات (NaCO)3, AR)
---- Trichloroacetic acid (AR)
---- Acetonitrile (AR)
---- ئېتىل كىسلاتاسى (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
---- دىئونلاشتۇرۇلغان سۇ
6. زاپچاس زاپچاسلىرى
l ئانتىگېن بىلەن سىرلانغان 96 قۇدۇق بار مىكرو تىپلىق تەخسە
l ئۆلچەملىك ھەل قىلىش چارىسى (5 بوتۇلكا ، 1ml / بوتۇلكا)
0ppb ، 0.5ppb ، 1.5ppb ، 4.5ppb ، 13.5ppb
l تېز سۈرئەتلىك ئۆلچەملىك كونترول: (1ml / بوتۇلكا)1ppm
l ئېنزىم بىرىكمىسى 1ml …………… ..… ..… قىزىل دوپپا
l ئانتىتېلا ئېرىتمىسى 7ml ………………. …… يېشىل دوپپا
l ھەل قىلىش چارىسى 7ml …………………….…. …… ئاق دوپپا
l ھەل قىلىش چارىسى B 7ml ... …………………………… ..red cap
l ھەل قىلىش چارىسىنى توختىتىڭ 7ml. ………………. ………. سېرىق دوپپا
l 20 × قويۇق يۇيۇش ئېرىتمىسى 40ml
………………………………… ..… سۈزۈك دوپپا
l 4 × مەركەزلەشتۈرۈلگەن ئېلىش ئېرىتمىسى 50ml
………………………………………………
7. رېئاكتور تەييارلاش:
ھەل قىلىش چارىسى 1:0.1mol / L NaOH ئېرىتمىسى
ئېغىرلىقى 0.4g NaOH دىن 100 مىللىمېتىرغىچە دېئونسىزلانغان سۇنى تولۇق ئارىلاشتۇرۇڭ.
Solution 2: 1mol / L NaOH ھەل قىلىش چارىسى
ئېغىرلىقى 4g NaOH دىن 100 مىللىمېتىرغىچە دىئونلانغان سۇنى تولۇق ئارىلاشتۇرۇڭ.
Solution 3: كاربونات بۇففېر تۇزى
ھەل قىلىش چارىسى1: 0.2M PB
Dissolve 51.6g of Na2HPO4· 12H2O, 8.7g of NaH2PO4· 2H2O دىئونلانغان سۇ بىلەن 1000 مىللىمېتىرغا سۇيۇلدۇرۇڭ.
ھەل قىلىش چارىسى2: ئېلىش چارىسى
2 × مەركەزلەشتۈرۈلگەن ئېلىش ئېرىتمىسىنى ھەجىم نىسبىتىدە دىئونسىزلانغان سۇ بىلەن سۇيۇلدۇرۇڭ (مەسىلەن 10ml 2 × ئېلىش ئېرىتمىسى + 10ml دىئونلانغان سۇ) ، ئەۋرىشكە ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ ،بۇ ھەل قىلىش چارىسىنى 4 at دە 1 ئاي ساقلىغىلى بولىدۇ.
ھەل قىلىش چارىسى3: ھەل قىلىش چارىسى
20 × مەركەزلەشتۈرۈلگەن يۇيۇش ئېرىتمىسىنى ھەجىم نىسبىتىدە دىئونلانغان سۇ بىلەن سۇيۇلدۇرۇڭ (مەسىلەن 5ml 20 × يۇيۇش ئېرىتمىسى + 95ml دىئونلانغان سۇ) ، بۇ تەخسىلەرنى يۇيۇشقا ئىشلىتىلىدۇ.بۇ ھەل قىلىش چارىسىنى 4 at 1 دە 1 ئاي ساقلىغىلى بولىدۇ.
8. ئەۋرىشكە تەييارلىقى
8.1 مەشغۇلاتتىن ئىلگىرى ئەسكەرتىش ۋە ئالدىنى ئېلىش تەدبىرلىرى:
(1) تەجرىبە جەريانىدا بىر قېتىمدىلا ئىشلىتىلىدىغان ئۇسۇللارنى ئىشلىتىڭ ، ئوخشىمىغان رېئاكتورنى سۈمۈرگەندە كۆرسەتمىنى ئۆزگەرتىڭ.
(2) بارلىق سايمانلارنىڭ پاكىز بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ.
(3) توقۇلما ئەۋرىشكىسىنى توڭلىتىش.
(4) تەييار ئەۋرىشكىنى بىراقلا تەكشۈرۈشكە ئىشلىتىش كېرەك.
8.2 ھايۋانات توقۇلمىلىرى (توخۇ ، چوشقا گۆشى قاتارلىقلار)
---- ئەۋرىشكىنى homogenizer بىلەن بىرلەشتۈرۈش;
---- 50ml پولىستىرېن مەركەزدىن ياسالغان نەيچىگە 2.0 ± 0.05g گوموگېنات ئېلىڭ.0.2M PB نىڭ 2ml نى قوشۇڭ (ھەل قىلىش چارىسى1) سىلكىپ ئېرىتىپ ، ئاندىن 8ml ئېتىل ئاتسېتات قوشۇپ ، 3 مىنۇت قاتتىق سىلكىڭ.
---- ئايرىش مەركىزى: 3000g / مۇھىت تېمپېراتۇرىسى / 5min.
---- خاسىيەتلىك ئورگانىك باسقۇچنىڭ 4ml نى 10 مىللىمېتىر ئەينەك تۇرۇبىغا يۆتكەڭ ، ئازوت گازىنىڭ ئاستىدا 50-60 ℃ سۇ مۇنچىسى بىلەن قۇرۇتىڭ.
---- قۇرۇق قالدۇقنى 1ml n-hexane ، 30-يىللاردىكى قاينام بىلەن ئېرىتىپ ، ئاندىن 1ml ئېلىش ئېرىتمىسى قوشۇڭ (ھەل قىلىش چارىسى2) ، قاينام 1 مىنۇت.ئايرىش ئۈچۈن مەركەزدىن قاچۇرۇش: 3000g / مۇھىت تېمپېراتۇرىسى / 5min
---- خاسىيەتلىك n-hexane باسقۇچىنى ئېلىۋېتىڭ.تەكشۈرۈش ئۈچۈن سۇ ئاستى باسقۇچىنىڭ 50μl نى ئېلىڭ.
سۇيۇقلاندۇرۇش ئامىلى: 1
8.2 سۈت
---- 100 مىللىلىتىر خام سۈت ئەۋرىشكىسىنى ئېلىپ ، 900μl ئېلىش ئېرىتمىسى بىلەن ئارىلاشتۇرۇڭ (ھەل قىلىش چارىسى2) ، ھەمدە تولۇق ئارىلاشتۇرۇڭ.
---- تەكشۈرۈش ئۈچۈن تەييارلانغان ھەل قىلىش چارىسىنىڭ 50μl نى ئېلىڭ.
سۇيۇقلاندۇرۇش ئامىلى: 10
9. تەكشۈرۈش جەريانى
9.1 تەكشۈرۈشتىن بۇرۇن ئۇقتۇرۇش
9.1.1بارلىق رېئاكتور ۋە مىكرو دولقۇنلارنىڭ ھەممىسىنىڭ ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا (20-25 ℃) بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىڭ.
9.1.2قالغان بارلىق رېئاكتورلارنى 2-8 گە قايتۇرۇڭ℃ئىشلىتىپ بولغاندىن كېيىنلا.
9.1.3مىكرو دولقۇننى توغرا يۇيۇش تەكشۈرۈش جەريانىدىكى مۇھىم قەدەم.ئۇ ELISA تەھلىلىنىڭ قايتا كۆپىيىشىدىكى مۇھىم ئامىل.
9.1.4 A.نۇرنى بىكار قىلىپ ، يوشۇرۇن ھالەتتە مىكرو دولقۇننى يېپىڭ.
9.2 قەدەم باسقۇچلىرى
9.2.1 بارلىق رېئاكتورلارنى ئۆي تېمپېراتۇرىسى (20-25 ℃) دىن 30 مىنۇتتىن كۆپرەك ئېلىڭ ، ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ئاستا سىلكىڭ.
9.2.2 لازىملىق مىكرو دولقۇننى ئېلىڭ ، قالغانلىرىنى دەرھال 2-8 at دە زىپ قۇلۇپ خالتىغا قايتۇرۇڭ.
9.2.3 سۇيۇقلاندۇرۇلغان يۇيۇش سۇيۇقلۇقىنى ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىدا بولۇشى كېرەك.
9.2.4نومۇرى:ھەر بىر مىكرو دولقۇنلۇق ئورۇننىڭ نومۇرى ۋە بارلىق ئۆلچەم ۋە ئەۋرىشكىلەرنى كۆپەيتىش كېرەك.ئۆلچەم ۋە ئەۋرىشكە ئورنىنى خاتىرىلەڭ.
9.2.5Add ئۆلچەملىك ھەل قىلىش چارىسى / ئەۋرىشكە ۋە ئانتىتېلا ئېرىتمىسى: 50µl ئۆلچەملىك ھەل قىلىش چارىسىنى قوشۇڭ ((kit تەمىنلەندى) ياكى مۇناسىپ قۇدۇقلارغا ئەۋرىشكە تەييارلىغان.50µl ئانتىتېلا ئېرىتمىسىنى قوشۇڭ (kit تەمىنلەندى).تەخسىنى قولدا سىلكىش ئارقىلىق يۇمشاق ئارىلاشتۇرۇپ ، 30 مىنۇتتا 37 cover مۇقاۋا بىلەن يېپىش.
9.2.6يۇيۇش: مۇقاۋىنى ئاستا-ئاستا ئېلىڭ ھەمدە قۇدۇقتىكى سۇيۇقلۇقنى ساپلاشتۇرۇڭ ھەمدە 250 مىللىمېتىر سۇيۇقلاندۇرۇلغان يۇيۇش ئېرىتمىسى بىلەن مىكرو دولقۇننى چايقىڭ (ھەل قىلىش چارىسى3) 10-5 ئارىلىقىدا 4-5 قېتىم.قالدۇق سۇنى سۈمۈرگۈچ قەغەز بىلەن سۈمۈرۈڭ (قالغان ھاۋا كۆپۈكلىرىنى ئىشلىتىلمىگەن ئۇچى بىلەن يوقاتقىلى بولىدۇ).
9.2.7فېرمېنت بىرىكمىسى قوشۇڭ: 100ml ئېنزىم بىرىكمە ئېرىتمىسىنى قوشۇڭ (kit تەمىنلەندى) ھەر بىر قۇدۇققا ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇپ ، 30 مىنۇتتا 37 ℃ مۇقاۋا بىلەن يېپىش.يۇيۇش قەدىمىنى قايتا تەكرارلاڭ.
9.2.8رەڭگى: 50µl ھەل قىلىش چارىسىنى قوشۇڭ (kit تەمىنلەندى) ۋە 50µl ھەل قىلىش چارىسى B (kit تەمىنلەندى) ھەر بىر قۇدۇققا.ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇڭ ۋە 15 مىنۇتتا 37 at مۇقاۋا بىلەن يېپىڭ.
9.2.9تەدبىر: توختىتىش ھەل قىلىش چارىسىنىڭ 50µl نى قوشۇڭ (kit تەمىنلەندى) ھەر بىر قۇدۇققا.ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇپ ، سۈمۈرۈلۈشنى 450nm دە ئۆلچەڭ (قوش دولقۇن ئۇزۇنلۇقى 450 / 630nm بىلەن ئۆلچەش تەۋسىيە قىلىنىدۇ. توختاپ ھەل قىلىش چارىسىنى قوشقاندىن كېيىن 5 مىنۇت ئىچىدە نەتىجىنى ئوقۇڭ).
10. نەتىجە
10.1 پىرسەنت سۈمۈرۈلۈش
ئۆلچەم ۋە ئەۋرىشكە ئۈچۈن قوبۇل قىلىنغان سۈمۈرۈلۈش قىممىتىنىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى بىرىنچى ئۆلچەم (نۆل ئۆلچەم) نىڭ سۈمۈرۈلۈش قىممىتىگە بۆلۈنۈپ ،% 100 كۆپەيتىلگەن.شۇڭا نۆل ئۆلچەم% 100 كە تەڭ بولۇپ ، سۈمۈرۈلۈش قىممىتى پىرسەنتتە نەقىل ئېلىنغان.
B
Absorbance (%) = —— × 100%
B0
B —— سۈمۈرگۈچ ئۆلچىمى (ياكى ئەۋرىشكە)
B0 —— سۈمۈرگۈچ نۆل ئۆلچەم
10.2 ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق
---- ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق سىزىش: ئۆلچەمنىڭ سۈمۈرۈلۈش قىممىتىنى y ئوقى ، تىلوسىن ئۆلچىمى ئېرىتمىسىنىڭ قويۇقلۇقىنىڭ يېرىم لوگارىزىمنى x ئوق قىلىپ ئېلىڭ.
---- تەقلىد قىلىش ئەگرى سىزىقىدىن ئوقۇشقا بولىدىغان ھەر بىر ئەۋرىشكە (ppb) نىڭ تىلوسىن قويۇقلۇقى كېيىنكى ھەر بىر ئەۋرىشكىنىڭ مۇناسىپ سۇيۇلۇش ئامىلى بىلەن كۆپەيتىلىپ ، ئەۋرىشكىنىڭ ئەمەلىي قويۇقلۇقىغا ئېرىشىدۇ.
دىققەت قىلىڭ:
تەلەپكە ئاساسەن تەمىنلىنىدىغان سانلىق مەلۇمات ئانالىزى ئۈچۈن ئالاھىدە يۇمشاق دېتال ياسالدى.
11. سەزگۈرلۈك ، توغرىلىق ۋە ئېنىقلىق
سىناق سەزگۈرلۈكى:1.5ppb
بايقاش چېكى:
ھايۋانلارنىڭ توقۇلمىلىرى …………………………. …………… 1.5ppb سۈت …………………………………………… .....… ..15ppb ئېنىقلىقى:
ھايۋانات توقۇلمىلىرى ………………………… ... ………… 80 ± 15%
سۈت ………………………………… .. ………. …… 80 ± 10%
ئېنىقلىق:
ELISA يۈرۈشلۈك زاپچاسلىرىنىڭ ئۆزگىرىش كوئېففىتسېنتى% 10 كىمۇ يەتمەيدۇ.
12. ئۇقتۇرۇش
12.1 ئەگەر رېئاكتور ۋە ئەۋرىشكە ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسى (20-25 ℃) گە تەڭشەلمىگەن بولسا ، ئۆلچەم ۋە ئەۋرىشكە ئۈچۈن قوبۇل قىلىنغان سۈمۈرۈلۈش قىممىتىنىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى تۆۋەنلەيدۇ.
12.2 مۇۋەپپەقىيەتلىك ھالدا كۆپىيىشتىن ساقلىنىش ئۈچۈن قەدەم باسقۇچلار ئارىسىدا مىكرو دولقۇنلارنىڭ قۇرۇشىغا يول قويماڭ ھەمدە مىكرو دولقۇنلۇق تۇتقۇچىنى چەككەندىن كېيىن كېيىنكى قەدەمدە مەشغۇلات قىلىڭ.
12.3 ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ھەر بىر رېئاكتورنى ئاستا سىلكىڭ.
12.4 تېرىڭىزنى توختىتىش ئېرىتمىسىدىن يىراقلاشتۇرۇڭ ، چۈنكى ئۇ 0.5MH2SO4ھەل قىلىش چارىسى.
12.5 يۈرۈشلۈك ئۈسكۈنىلەرنى ۋاقتى ئۆتۈپ كەتمەڭ.ئوخشىمىغان تۈركۈمدىكى رېئاكتورنى ئالماشتۇرماڭ ، بولمىسا سەزگۈرلۈكنى تۆۋەنلىتىدۇ.
12.6 ELISA زاپچاسلىرىنى 2-8 at دە ساقلاڭ ، توڭلىماڭ.ئارام ئېلىش مىكرو دولقۇن تاختىسىنى پېچەتلەڭ ، بارلىق يوشۇرۇن ھالەتتە بىۋاسىتە قۇياش نۇرىدىن ساقلىنىڭ.مىكرو تىپلىق پىلاستىنكىلارنى يېپىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
12.7 ئەگەر رەڭگە ئايلانسا ، ئاستى ئېرىتمىنى تاشلاش كېرەك.ئەگەر نۆل ئۆلچەمنىڭ سۈمۈرۈلۈش قىممىتى (450 / 630nm) 0.5 (A450nm <0.5) دىن تۆۋەن بولسا ، رېئاكتور ناچارلىشىشى مۇمكىن.
12.8 A ھەل قىلىش چارىسى ۋە B ھەل قىلىش لايىھىسى قوشۇلغاندىن كېيىن رەڭلىك رېئاكسىيە 15 مىنۇتقا ئېھتىياجلىق بولىدۇ ، ئەگەر رەڭ بەك يېنىك بولسا ئېنىقلاش ۋاقتى 20 مىنۇت ياكى ئۇنىڭدىن يۇقىرى بولىدۇ.ھەرگىزمۇ 30 مىنۇتتىن ئېشىپ كەتمەڭ ، ئەكسىچە ، يوشۇرۇن ۋاقتىنى مۇۋاپىق قىسقارتىڭ.
12.9 ئەڭ ياخشى ئىنكاس تېمپېراتۇرىسى 37 is.يۇقىرى ياكى تۆۋەن تېمپېراتۇرا سەزگۈرلۈك ۋە سۈمۈرۈلۈش قىممىتىنىڭ ئۆزگىرىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
13. ساقلاش
ساقلاش ھالىتى: 2-8 ℃.
ساقلاش مۇددىتى: 12 ئاي.
