Idije Enzyme Immunoassay Kit fun Itupalẹ Pipo ti Tylosin
Idije Enzyme Immunoassay Kit fun
Pipo Analysis ofTylosin
1. abẹlẹ
Tylosinjẹ apakokoro macrolide, eyiti a lo ni pataki bi antibacterial ati anti-mycoplasma.Awọn MRL ti o muna ni a ti fi idi mulẹ nitori oogun yii le ja si ipa ẹgbẹ to ṣe pataki ni awọn ẹgbẹ kan.
Ohun elo yii jẹ ọja tuntun ti o da lori imọ-ẹrọ ELISA, eyiti o yara, irọrun, deede ati ifarabalẹ ni akawe pẹlu itupalẹ ohun elo ti o wọpọ ati pe o nilo awọn wakati 1.5 nikan ni iṣẹ kan, o le dinku aṣiṣe iṣẹ ṣiṣe ati kikankikan iṣẹ.
2. Igbeyewo Ilana
Ohun elo yii da lori imọ-ẹrọ ELISA aiṣe-idije.Awọn kanga microtiter ti wa ni ti a bo pẹlu antijeni pọ.Ajẹkù Tylosin ninu ayẹwo ti njijadu pẹlu antijeni ti a bo lori awo microtiter fun agboguntaisan.Lẹhin afikun ti enzymu ti a samisi egboogi-egboogi, a lo sobusitireti TMB lati ṣafihan awọ naa.Absorbance ti ayẹwo jẹ ni odi ni ibatan si tylosin ti ngbe inu rẹ, lẹhin ti a ba ṣe afiwe pẹlu Standard Curve, ti o pọ si nipasẹ ifosiwewe dilution, iye aloku tylosin ninu apẹẹrẹ le ṣe iṣiro.
3. Awọn ohun elo
Ohun elo yii le ṣee lo ni pipo ati igbekale agbara ti aloku tylosin ninu ẹran ara (adie, ẹran ẹlẹdẹ, ewure) ati wara, oyin, ẹyin, ati bẹbẹ lọ.
4. Cross-aati
Tylosin………………………………………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………………………………………………
5. Awọn ohun elo ti a beere
5.1 Awọn ohun elo:
spectrophotometer awo Microtiter (450nm/630nm)
----Iyipo evaporator tabi awọn ohun elo gbigbe nitrogen
---- homogenizer
----Shaker
----Centrifuge
---- Iwọntunwọnsi itupalẹ (inductance: 0.01g)
---- pipette ti o gboye: 10ml
---- Roba pipette boolubu
----Iwọn igo: 10ml
----Polystyrene centrifuge tubes: 50ml
----Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Awọn atunṣe:
----Sodium hydroxide (NaOH, AR)
---- sodium bicarbonate (NaHCO3,AR)
---- Sodium carbonate (NaCO3, AR)
---- Trichloroacetic acid (AR)
---- Acetonitrile (AR)
----Ethyl acetate (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----Omi ti a fi omi ṣan
6. Kit irinše
l Microtiter awo pẹlu 96 kanga ti a bo pẹlu antijeni
l Awọn ojutu boṣewa (igo 5, 1 milimita / igo)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Iṣakoso boṣewa Spiking: (1ml/igo)1ppm
l Enzyme conjugate 1ml……………………………….… fila pupa
l ojutu Antibody 7ml………………………………. fila alawọ ewe
l Solusan A 7ml …………………………………………………. fila funfun
l Solusan B 7ml…………………………………………. fila pupa
l Idaduro ojutu 7ml.………………………………. fila ofeefee
l 20× ogidi w ojutu 40ml
…………………………………………………. … fila sihin
l 4× ojutu isediwon ogidi 50ml
…………………………………………………………………. fila buluu
7. Igbaradi Reagents:
Ojutu 1:0.1mol / L NaOH ojutu
Ṣe iwọn 0.4g NaOH si 100ml omi deionized ati ki o dapọ patapata.
Ojutu 2: 1mol / L NaOH ojutu
Ṣe iwọn 4g NaOH si 100ml omi deionized ati ki o dapọ patapata.
Ojutu 3: Carbonate saarin iyọ
Ojutu1: 0.2M PB
Tu 51.6g ti Na2HPO4· 12H2O, 8.7g ti NaH2PO4· 2H2Eyin pẹlu deionized omi ati dilute to 1000ml.
Ojutu2: ojutu isediwon
Di ojutu isediwon 2× ogidi pẹlu omi deionized ni ipin iwọn didun ti 1: 1(fun apẹẹrẹ 10ml ti 2× isediwon ojutu + 10ml ti deionized omi), eyi ti yoo ṣee lo fun isediwon ayẹwo,ojutu yii le wa ni ipamọ ni iwọn 4 ℃ fun oṣu kan.
Ojutu3: Fifọ ojutu
Di omi ojutu ifọkansi 20 × 20 pẹlu omi deionized ni ipin iwọn didun ti 1:19(fun apẹẹrẹ 5ml ti ojutu fifọ 20× + 95ml ti omi ti a ti diionized), eyi ti ao lo fun fifọ awọn awo.Ojutu yii le wa ni ipamọ ni 4 ℃ fun oṣu kan.
8. Apeere Ipalemo
8.1 Akiyesi ati awọn iṣọra ṣaaju ṣiṣe:
(a) Jọwọ lo ọkan-pipa awọn italologo ninu awọn ilana ti ṣàdánwò, ki o si yi awọn italologo nigbati fa orisirisi reagent.
(b) Rii daju pe gbogbo awọn ohun elo jẹ mimọ.
(c) Jeki ayẹwo àsopọ ni didi.
(d) Apeere ti a pese sile yẹ ki o lo fun idanwo ni ẹẹkan.
8.2 Ẹranko ẹran (adie, ẹran ẹlẹdẹ, ati bẹbẹ lọ)
----Homogenize awọn ayẹwo pẹlu homogenizer;
--- Mu 2.0 ± 0.05g ti homogenate sinu tube centrifuge polystyrene 50ml;fi 2ml ti 0.2M PB (ojutu1) , gbọn lati tu, ati lẹhinna fi 8ml ti ethyl acetate kun ati ki o gbọn fifẹ fun 3min;
----Centrifuge fun Iyapa: 3000g / otutu ibaramu / 5min.
--- Gbigbe 4ml ti ipele Organic supernatant sinu tube gilasi 10ml, gbẹ pẹlu 50-60℃ omi iwẹ labẹ ṣiṣan gaasi nitrogen;
---- Tu ajẹkù ti o gbẹ pẹlu 1ml ti n-hexane, vortex fun 30s lati tu, ati lẹhinna ṣafikun 1ml ti ojutu isediwon (ojutu2), vortex fun iṣẹju 1.centrifuge fun Iyapa: 3000g / ibaramu otutu / 5min
----Yọ awọn supernatant n-hexane alakoso;ya 50μl ti awọn sobusitireti olomi alakoso fun assay.
Ifipo ifosiwewe: 1
8.2 wara
---- Mu 100μl ti apẹẹrẹ wara aise, dapọ pẹlu 900μl ti ojutu isediwon (ojutu2), ki o si dapọ patapata.
---- Mu 50μl ti ojutu ti a pese silẹ fun ayẹwo.
Ifipo ifosiwewe: 10
9. Ilana ayẹwo
9.1 Ṣe akiyesi ṣaaju ayẹwo
9.1.1Rii daju pe gbogbo awọn reagents ati microwells wa ni iwọn otutu yara (20-25 ℃).
9.1.2Pada gbogbo awọn reagents iyokù pada si 2-8℃lẹsẹkẹsẹ lẹhin lilo.
9.1.3Fifọ awọn microwells ni ọna ti o tọ jẹ igbesẹ pataki ninu ilana idanwo;o jẹ ifosiwewe pataki si isọdọtun ti itupalẹ ELISA.
9.1.4 Aofo ni ina ati ki o bo awọn microwells nigba abeabo.
9.2 Assay Igbesẹ
9.2.1 Mu gbogbo reagents jade ni yara otutu (20-25 ℃) fun diẹ ẹ sii ju 30min, gbọn rọra ṣaaju lilo.
9.2.2 Gba awọn microwells ti o nilo jade ki o da iyoku pada sinu apo titiipa zip ni 2-8℃ lẹsẹkẹsẹ.
9.2.3 Ojutu fifọ ti a fomi yẹ ki o tun ṣe atunṣe lati wa ni iwọn otutu yara ṣaaju lilo.
9.2.4Nọmba:Nọmba gbogbo awọn ipo microwell ati gbogbo awọn iṣedede ati awọn ayẹwo yẹ ki o ṣiṣẹ ni ẹda-ẹda.Ṣe igbasilẹ awọn iṣedede ati awọn ipo apẹẹrẹ.
9.2.5Add boṣewa ojutu/ayẹwo ati ojutu antibody: Ṣafikun 50µl ti ojutu boṣewa (((kit pese)) tabi apẹẹrẹ ti a pese silẹ si awọn kanga ti o baamu.Fi 50µl ti ojutu antibody kun (kit pese).Illa rọra nipa gbigbọn awo pẹlu ọwọ ati incubate fun 30min ni 37℃ pẹlu ideri.
9.2.6Fọ: Yọ ideri naa rọra ki o si wẹ omi naa kuro ninu awọn kanga ki o fi omi ṣan awọn microwells pẹlu 250µl ti fomi ojutu (250µl).ojutu3) ni aarin ti 10s fun 4-5times.Fa omi to ku pẹlu iwe ifamọ (okuta afẹfẹ iyokù le yọkuro pẹlu imọran ti ko lo).
9.2.7Fi enzymu conjugate kunFi 100ml ti ojutu conjugate enzymu kun (kit pese) si kanga kọọkan, dapọ rọra ati incubate fun 30min ni 37 ℃ pẹlu ideri.Tun igbesẹ fifọ lẹẹkansi.
9.2.8Awọ: Ṣafikun 50µl ti ojutu A(kit peseati 50µl ti ojutu B (kit pese) si kanga kọọkan.Illa rọra ati incubate fun iṣẹju 15 ni 37℃ pẹlu ideri.
9.2.9Iwọn: Ṣafikun 50µl ti ojutu iduro (kit pese) si kanga kọọkan.Illa rọra ki o si wiwọn awọn absorbance ni 450nm (O ti wa ni daba odiwon pẹlu awọn meji-wefulenti ti 450/630nm. Ka esi laarin 5min lẹhin fifi Duro ojutu).
10. esi
10,1 Ogorun absorbance
Awọn iye iwọn ti awọn iye ifunmọ ti a gba fun awọn iṣedede ati awọn apẹẹrẹ ti pin nipasẹ iye gbigba ti boṣewa akọkọ (boṣewa odo) ati isodipupo nipasẹ 100%.Iwọnwọn odo jẹ bayi jẹ dogba si 100% ati awọn iye gbigba ni a sọ ni awọn ipin ogorun.
B
Imukuro (%) = —— ×100%
B0
B ——boṣewa gbigba (tabi apẹẹrẹ)
B0 ——absorbance odo bošewa
10.2 Standard ekoro
----Lati fa a boṣewa ti tẹ: Mu absorbance iye ti awọn ajohunše bi y-axis, ologbele logarithmic ti awọn fojusi ti awọn tylosin awọn ajohunše ojutu (ppb) bi x-apa.
---- Idojukọ tylosin ti ayẹwo kọọkan (ppb), eyiti a le ka lati ọna kika, ti wa ni isodipupo nipasẹ ifosiwewe Dilution ti o baamu ti ayẹwo kọọkan ti o tẹle, ati pe a gba ifọkansi gangan ti ayẹwo.
Jọwọ ṣe akiyesi:
pataki software ti a ti ni idagbasoke fun data onínọmbà, eyi ti o le wa ni pese lori ìbéèrè.
11. ifamọ, išedede ati konge
Idanwo Ifamọ:1.5ppb
Iwọn wiwa:
Ẹranko ẹran …………………………………………………………………………………………………………………………………….1.5ppb Wara ....................................................... ..... ................. .............,.15ppB Yiye:
Ẹranko ẹran …………………………………………………………………………… 80± 15%
Wara ................................... .. .......... ...... 80 ± 10%
Itọkasi:
Olusọdipúpọ iyatọ ti ohun elo ELISA ko kere ju 10%.
12. Akiyesi
12.1 Awọn iye iwọn ti awọn iye gbigba ti o gba fun awọn iṣedede ati awọn ayẹwo yoo dinku ti awọn atunto ati awọn ayẹwo ko ba ti ni ilana si iwọn otutu yara (20-25 ℃).
12.2 Ma ṣe jẹ ki awọn microwells gbẹ laarin awọn igbesẹ lati yago fun atunṣe aṣeyọri ati ṣiṣẹ ni igbesẹ ti n tẹle lẹsẹkẹsẹ lẹhin ti o tẹ ohun mimu microwells.
12.3 Gbọn kọọkan reagent rọra ṣaaju lilo.
12.4 Jeki awọ ara rẹ kuro ni ojutu iduro fun o jẹ 0.5MH2SO4ojutu.
12.5 Maṣe lo awọn ohun elo ti ọjọ.Maṣe paarọ awọn reagents ti awọn ipele oriṣiriṣi, bibẹẹkọ yoo ju ifamọ naa silẹ.
12.6 Jeki awọn ohun elo ELISA ni 2-8℃, ma ṣe di.Di awọn apẹrẹ microwell isinmi, Yago fun imọlẹ orun taara lakoko gbogbo awọn ifisi.Ibora awọn apẹrẹ microtiter ni a ṣe iṣeduro.
12.7 Ojutu sobusitireti yẹ ki o kọ silẹ ti o ba yi awọn awọ pada.Awọn reagents le jẹ buburu ti iye gbigba (450/630nm) ti boṣewa odo jẹ kere ju 0.5 (A450nm <0.5).
12.8 Idahun awọ nilo 15min lẹhin afikun ti ojutu A ati ojutu B. Ati pe o le fa awọn sakani akoko idabo si 20min tabi diẹ sii ti awọ ba jẹ imọlẹ pupọ lati pinnu.Maṣe kọja iṣẹju 30, ni ilodi si, kuru akoko isubu daradara.
12.9 Awọn iwọn otutu lenu ti o dara julọ jẹ 37 ℃.Iwọn giga tabi isalẹ yoo yorisi awọn iyipada ti ifamọ ati awọn iye gbigba.
13. Ibi ipamọ
Ipo ipamọ: 2-8℃.
Akoko ipamọ: 12 osu.
