Kit Immunoassay Enzim Kompetitif untuk Analisis Kuantitatif Tylosin
Kit Immunoassay Enzim Kompetitif untuk
Analisis Kuantitatif bagiTylosin
1. Latar belakang
Tylosinadalah antibiotik makrolida, yang digunakan terutamanya sebagai antibakteria dan anti-mycoplasma.MRL yang ketat telah ditubuhkan kerana ubat ini boleh membawa kepada kesan sampingan yang serius dalam kumpulan tertentu.
Kit ini adalah produk baharu berasaskan teknologi ELISA, yang pantas, mudah, tepat dan sensitif berbanding dengan analisis instrumental biasa dan hanya memerlukan 1.5 jam dalam satu operasi, ia boleh meminimumkan ralat operasi dan keamatan kerja dengan ketara.
2. Prinsip Ujian
Kit ini adalah berdasarkan teknologi ELISA persaingan tidak langsung.Telaga mikrotiter disalut dengan antigen gandingan.Sisa tylosin dalam sampel bersaing dengan antigen yang disalut pada plat mikrotiter untuk antibodi.Selepas penambahan enzim berlabel anti-antibodi, substrat TMB digunakan untuk menunjukkan warna.Penyerapan sampel berkait negatif dengan tylosin yang berada di dalamnya, selepas membandingkan dengan Keluk Piawai, didarab dengan faktor pencairan, kuantiti sisa tylosin dalam sampel boleh dikira.
3. Aplikasi
Kit ini boleh digunakan dalam analisis kuantitatif dan kualitatif sisa tylosin dalam tisu haiwan (ayam, daging babi, itik) dan susu, madu, telur, dll.
4. Tindak balas silang
Tylosin……………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………<2%
5. Bahan yang Diperlukan
5.1 Peralatan:
----Spektrofotometer plat mikrotiter (450nm/630nm)
---- Alat penyejat berputar atau pengeringan nitrogen
----penghomogen
---- Goncang
----Empar
----Imbangan analitikal (kearuhan: 0.01g)
----Pipet lulus: 10ml
---- Mentol pipet getah
----Kelalang isipadu: 10ml
----Tiub empar polistirena: 50ml
----Mikropipet: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Reagen:
----Natrium hidroksida (NaOH, AR)
----Natrium bikarbonat (NaHCO3,AR)
---- Natrium karbonat (NaCO3, AR)
----Asid trichloroacetic (AR)
---- Asetonitril (AR)
----Etil asetat (AR)
┅┅n-Heksana (AR)
----Air deionisasi
6. Komponen Kit
l Plat mikrotiter dengan 96 telaga bersalut antigen
l Penyelesaian standard (5 botol, 1ml/botol)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Kawalan standard spiking: (1ml/botol)1ppm
l Enzim konjugat 1ml…………………...penutup merah
l Larutan antibodi 7ml……………………………………. penutup hijau
l Penyelesaian A 7ml…………………………………..penutup putih
l Penyelesaian B 7ml...………………………………………………. penutup merah
l Hentikan larutan 7ml.…………………….……….penutup kuning
l 20×larutan basuhan pekat 40ml
…………………………………..…topi lutsinar
l 4×larutan perahan pekat 50ml
…………………………………………….topi biru
7. Penyediaan Reagen:
Penyelesaian 1:0.1mol/L larutan NaOH
Timbang 0.4g NaOH hingga 100ml air ternyahion dan campurkan sepenuhnya.
Penyelesaian 2: 1mol/L larutan NaOH
Timbang 4g NaOH hingga 100ml air ternyahion dan kacau hingga sebati.
Penyelesaian 3: Garam penimbal berkarbonat
Penyelesaian1: 0.2M PB
Larutkan 51.6g Na2HPO4·12H2O, 8.7g NaH2PO4·2H2O dengan air ternyahion dan cairkan kepada 1000ml.
Penyelesaian2: Penyelesaian pengekstrakan
Cairkan larutan pengekstrakan 2×pekat dengan air ternyahion dalam nisbah isipadu 1:1(cth 10ml 2×larutan perahan + 10ml air ternyahion), yang akan digunakan untuk pengekstrakan sampel,larutan ini boleh disimpan pada suhu 4℃ selama 1 bulan.
Penyelesaian3: Cuci larutan
Cairkan larutan pencuci 20×pekat dengan air ternyahion dalam nisbah isipadu 1:19(cth 5ml larutan 20×cuci + 95ml air ternyahion), yang akan digunakan untuk membasuh pinggan.Penyelesaian ini boleh disimpan pada suhu 4 ℃ selama 1 bulan.
8. Persediaan Contoh
8.1 Notis dan langkah berjaga-jaga sebelum operasi:
(a) Sila gunakan petua sekali sahaja dalam proses eksperimen, dan tukar petua apabila menyerap reagen yang berbeza.
(b) Pastikan semua alatan dalam keadaan bersih.
(c) Simpan sampel tisu dalam keadaan beku.
(d) Sampel yang telah disediakan hendaklah digunakan untuk ujian sekaligus.
8.2 Tisu haiwan (ayam, daging babi, dll)
----Homogenkan sampel dengan homogenizer;
----Ambil 2.0±0.05g homogenat ke dalam tiub empar polistirena 50ml;tambah 2ml 0.2M PB (penyelesaian1) , goncang untuk larut, dan kemudian tambah 8ml etil asetat dan goncang dengan kuat selama 3 minit;
----Empar untuk pengasingan: 3000g / suhu ambien / 5min.
---- Pindahkan 4ml fasa organik supernatan ke dalam tiub kaca 10ml, kering dengan mandi air 50-60 ℃ di bawah aliran gas nitrogen;
----Larutkan sisa kering dengan 1ml n-heksana, vorteks selama 30s untuk larut, dan kemudian tambah 1ml larutan pengekstrakan (penyelesaian2), pusaran selama 1 minit.emparan untuk pengasingan: 3000g / suhu ambien / 5min
----Alih keluar fasa n-heksana supernatan;ambil 50μl fasa akueus substrat untuk ujian.
Faktor pencairan: 1
8.2 Susu
----Ambil 100μl sampel susu mentah, campurkan dengan 900μl larutan perahan (penyelesaian2), dan campurkan sepenuhnya.
----Ambil 50μl larutan yang disediakan untuk ujian.
Faktor pencairan: 10
9. Proses ujian
9.1 Notis sebelum ujian
9.1.1Pastikan semua reagen dan microwell semuanya pada suhu bilik (20-25 ℃).
9.1.2Kembalikan semua reagen selebihnya kepada 2-8℃serta-merta selepas digunakan.
9.1.3Mencuci microwell dengan betul adalah langkah penting dalam proses ujian;ia adalah faktor penting kepada kebolehulangan analisis ELISA.
9.1.4 Akosongkan cahaya dan tutup perigi mikro semasa pengeraman.
9.2 Langkah-langkah Pengujian
9.2.1 Keluarkan semua reagen pada suhu bilik (20-25 ℃) selama lebih daripada 30 minit, goncang perlahan-lahan sebelum digunakan.
9.2.2 Keluarkan perigi mikro yang diperlukan dan kembalikan selebihnya ke dalam beg kunci zip pada suhu 2-8 ℃ serta-merta.
9.2.3 Larutan pencuci yang telah dicairkan hendaklah dipanaskan semula pada suhu bilik sebelum digunakan.
9.2.4Nombor:Dinomborkan setiap kedudukan microwell dan semua piawaian dan sampel hendaklah dijalankan dalam pendua.Catatkan kedudukan piawai dan sampel.
9.2.5Add larutan piawai/sampel dan larutan antibodi: Tambah 50µl larutan piawai((kit disediakan)) atau sampel yang disediakan ke telaga yang sepadan.Tambah 50µl larutan antibodi (kit disediakan).Campurkan perlahan-lahan dengan menggoncang pinggan secara manual dan mengeram selama 30 minit pada 37 ℃ dengan penutup.
9.2.6Basuh: Tanggalkan penutup perlahan-lahan dan bersihkan cecair daripada telaga dan bilas telaga mikro dengan larutan pencuci cair 250µl (penyelesaian3) pada selang 10s selama 4-5 kali.Serap sisa air dengan kertas penyerap (selebihnya gelembung udara boleh disingkirkan dengan hujung yang tidak digunakan).
9.2.7Tambah konjugat enzim: Tambah 100ml larutan konjugat enzim(kit disediakan) ke setiap perigi, gaul perlahan-lahan dan eramkan selama 30 minit pada suhu 37 ℃ dengan penutup.Ulangi langkah mencuci sekali lagi.
9.2.8Mewarna: Tambahkan 50µl larutan A(kit disediakan) dan 50µl larutan B(kit disediakan) ke setiap sumur.Campurkan perlahan-lahan dan eramkan selama 15 minit pada suhu 37 ℃ dengan penutup.
9.2.9ukur: Tambahkan 50µl larutan henti(kit disediakan) ke setiap sumur.Campurkan perlahan-lahan dan ukur penyerapan pada 450nm (Sukatan yang dicadangkan dengan dwi-panjang gelombang 450/630nm. Baca hasilnya dalam masa 5 minit selepas menambah larutan henti).
10. Keputusan
10.1 Peratusan penyerapan
Nilai min nilai penyerapan yang diperolehi untuk piawaian dan sampel dibahagikan dengan nilai penyerapan piawai pertama (standard sifar ) dan didarab dengan 100%.Oleh itu, piawai sifar dibuat bersamaan dengan 100% dan nilai penyerapan disebut dalam peratusan.
B
Penyerapan (%) = —— ×100%
B0
B ——standard penyerapan (atau sampel)
B0 ——standard sifar penyerapan
10.2 Keluk Piawai
----Untuk melukis lengkung piawai: Ambil nilai penyerapan piawai sebagai paksi-y, separuh logaritma kepekatan larutan piawai tylosin (ppb) sebagai paksi-x.
----Kepekatan tylosin setiap sampel (ppb), yang boleh dibaca daripada lengkung penentukuran, didarab dengan faktor Pencairan yang sepadan bagi setiap sampel yang diikuti, dan kepekatan sebenar sampel diperolehi.
Sila ambil perhatian:
perisian khas telah dibangunkan untuk analisis data, yang boleh disediakan atas permintaan.
11. Kepekaan, ketepatan dan ketepatan
Sensitiviti Ujian:1.5ppb
Had pengesanan:
Tisu haiwan……………………………………………………1.5ppb Susu………………………………………………………………..15ppb Ketepatan:
Tisu haiwan………………………………………………80±15%
Susu…………………………………..……….……80±10%
Ketepatan:
Pekali variasi kit ELISA adalah kurang daripada 10%.
12. Makluman
12.1 Nilai min nilai penyerapan yang diperolehi untuk piawaian dan sampel akan dikurangkan jika reagen dan sampel tidak dikawal pada suhu bilik (20-25 ℃).
12.2 Jangan biarkan perigi mikro kering di antara langkah-langkah untuk mengelakkan kebolehulangan yang tidak berjaya dan kendalikan langkah seterusnya serta-merta selepas mengetuk pemegang perigi mikro.
12.3 Goncang setiap reagen perlahan-lahan sebelum digunakan.
12.4 Jauhkan kulit anda daripada larutan henti kerana ia adalah 0.5MH2SO4penyelesaian.
12.5 Jangan gunakan kit yang sudah lapuk.Jangan tukar reagen kumpulan yang berbeza, jika tidak, ia akan menurunkan sensitiviti.
12.6 Simpan kit ELISA pada suhu 2-8 ℃, jangan beku.Kedap plat microwell rehat, Elakkan cahaya matahari lurus semasa semua pengeraman.Meliputi plat mikrotiter adalah disyorkan.
12.7 Larutan substrat hendaklah ditinggalkan jika ia bertukar warna.Reagen mungkin menjadi buruk jika nilai penyerapan (450/630nm) piawai sifar adalah kurang daripada 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 Tindak balas pewarnaan memerlukan 15 minit selepas penambahan larutan A dan larutan B. Dan anda boleh memanjangkan julat masa pengeraman kepada 20 minit atau lebih jika warna terlalu terang untuk ditentukan.Jangan melebihi 30 minit, sebaliknya, pendekkan masa pengeraman dengan betul.
12.9 Suhu tindak balas optimum ialah 37 ℃.Suhu yang lebih tinggi atau lebih rendah akan membawa kepada perubahan nilai sensitiviti dan penyerapan.
13. Penyimpanan
Keadaan penyimpanan: 2-8 ℃.
Tempoh penyimpanan: 12 bulan.
