Kit de Imunoensaio Enzimático Competitivo para Análise Quantitativa de Tilosina
Kit de imunoensaio enzimático competitivo para
Análise Quantitativa detilosina
1. Fundo
tilosinaé um antibiótico macrólido, que é aplicado principalmente como antibacteriano e anti-micoplasma.LMRs estritos foram estabelecidos, uma vez que esta droga pode levar a efeitos colaterais graves em certos grupos.
Este kit é um novo produto baseado na tecnologia ELISA, que é rápido, fácil, preciso e sensível em comparação com a análise instrumental comum e precisa apenas de 1,5 horas em uma operação, pode minimizar consideravelmente o erro de operação e a intensidade do trabalho.
2. Princípio do Teste
Este kit é baseado na tecnologia ELISA de competição indireta.Os poços de microtitulação são revestidos com antígeno de acoplamento.O resíduo de tilosina na amostra compete com o antígeno revestido na placa de microtitulação pelo anticorpo.Após a adição de anti-anticorpo marcado com enzima, o substrato TMB é usado para mostrar a cor.A absorvância da amostra está negativamente relacionada com a tilosina nela contida, depois de comparar com a Curva Padrão, multiplicada pelo fator de diluição, a quantidade de resíduo de tilosina na amostra pode ser calculada.
3. Aplicações
Este kit pode ser utilizado em análises quantitativas e qualitativas de resíduos de tilosina em tecidos animais (frango, porco, pato) e leite, mel, ovo, etc.
4. Reações cruzadas
Tilosina……………………………………………..100%
Tilmicosina……………………………………………<2%
5. Materiais Necessários
5.1 Equipamentos:
----Espectrofotômetro de placa de microtitulação (450nm/630nm)
----Evaporador rotativo ou instrumentos de secagem de nitrogênio
----homogeneizador
----Shaker
---- Centrifuga
----Balanço analítico (indutância: 0,01g)
---- Pipeta graduada: 10ml
---- Bulbo de pipeta de borracha
----Frasco volumétrico: 10ml
----Tubos de centrífuga de poliestireno: 50ml
----Micropipetas: 20-200ml, 100-1000ml
multipipeta de 250ml
5.2 Reagentes:
----Hidróxido de sódio (NaOH, AR)
----Bicarbonato de sódio (NaHCO3,AR)
---- Carbonato de sódio (NaCO3, AR)
----Ácido tricloroacético (AR)
---- Acetonitrila (AR)
---- Acetato de etila (AR)
┅┅n-hexano (AR)
----Água desionizada
6. Componentes do Kit
l Placa de microtitulação com 96 poços revestidos com antígeno
l Soluções padrão (5 frascos, 1ml/frasco)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Spiking controle padrão: (1ml/frasco)1ppm
l Conjugado enzimático 1ml……………..…..…tampa vermelha
l Solução de anticorpos 7ml……………….……tampa verde
l Solução A 7ml…………………….….……tampa branca
l Solução B 7ml...……………………………..tampa vermelha
l Solução Stop 7ml.……………….……….tampa amarela
l 20×solução de lavagem concentrada 40ml
…………………………………..…tampa transparente
l 4×solução de extração concentrada 50ml
……………………………………………….boné azul
7. Preparação dos reagentes:
Solução 1:Solução de NaOH 0,1mol/L
Pesar 0,4 g de NaOH para 100 ml de água desionizada e misturar completamente.
Solução 2: solução de NaOH 1mol/L
Pesar 4 g de NaOH para 100 ml de água desionizada e misturar completamente.
Solução 3: sal de tampão carbonato
Solução1: 0,2M PB
Dissolva 51,6 g de Na2HPO4·12H2O, 8,7 g de NaH2PO4·2H2O com água deionizada e diluir para 1000ml.
Solução2: Solução de extração
Dilua a solução de extração 2×concentrada com água deionizada na proporção de volume de 1:1 (por exemplo, 10ml de solução de extração 2× + 10ml de água deionizada), que serão utilizadas para extração de amostras,esta solução pode ser armazenada a 4 ℃ por 1 mês.
Solução3: Solução de lavagem
Dilua a solução de lavagem concentrada 20× com água deionizada na proporção de volume de 1:19 (por exemplo, 5ml de solução de lavagem 20× + 95ml de água desionizada), que serão utilizados para a lavagem das placas.Esta solução pode ser armazenada a 4 ℃ por 1 mês.
8. Preparações de amostras
8.1 Aviso e precauções antes da operação:
(a) Por favor, use pontas únicas no processo de experimento e troque as pontas quando absorver um reagente diferente.
(b) Certifique-se de que todos os instrumentos estejam limpos.
(c) Manter a amostra de tecido congelada.
(d) A amostra preparada deve ser usada para análise imediatamente.
8.2 Tecido animal (frango, porco, etc)
----Homogeneize a amostra com homogeneizador;
----Coloque 2,0±0,05g de homogeneizado em um tubo de centrífuga de poliestireno de 50ml;adicione 2ml de 0,2M PB (solução1), agite para dissolver e, em seguida, adicione 8ml de acetato de etila e agite vigorosamente por 3min;
----Centrífuga para separação: 3000g / temperatura ambiente / 5min.
----Transfira 4ml da fase orgânica sobrenadante para um tubo de vidro de 10ml, seque com banho-maria a 50-60℃ sob fluxo de gás nitrogênio;
----Dissolva a sobra seca com 1ml de n-hexano, vórtex por 30s para dissolver e, em seguida, adicione 1ml de solução de extração (solução2), vortex por 1min.centrífuga para separação: 3000g / temperatura ambiente / 5min
----Remover a fase n-hexano sobrenadante;tomar 50μl da fase aquosa do substrato para ensaio.
Fator de diluição: 1
8.2 Leite
----Pegue 100μl de amostra de leite cru, misture com 900μl de solução de extração (solução2) e misture bem.
----Pegue 50μl da solução preparada para análise.
Fator de diluição: 10
9. Processo de ensaio
9.1 Aviso antes do ensaio
9.1.1Certifique-se de que todos os reagentes e micropoços estejam à temperatura ambiente (20-25 ℃).
9.1.2Retorne todos os reagentes restantes para 2-8℃imediatamente após o uso.
9.1.3A lavagem correta dos micropoços é uma etapa importante no processo de ensaio;é o fator vital para a reprodutibilidade da análise ELISA.
9.1.4Aanule a luz e cubra os micropoços durante a incubação.
9.2 Etapas do ensaio
9.2.1 Retire todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25 ℃) por mais de 30 minutos, agite suavemente antes de usar.
9.2.2 Retire os micropoços necessários e retorne o restante para o saco zip-lock a 2-8℃ imediatamente.
9.2.3 A solução de lavagem diluída deve ser reaquecida à temperatura ambiente antes do uso.
9.2.4Número:Cada posição do micropoço numerada e todos os padrões e amostras devem ser executados em duplicado.Registre as posições dos padrões e amostras.
9.2.5Add solução padrão/amostra e solução de anticorpo: Adicione 50µl de solução padrão((kit fornecido)) ou amostra preparada para os poços correspondentes.Adicione 50 µl de solução de anticorpo (kit fornecido).Misture suavemente agitando a placa manualmente e incube por 30 minutos a 37 ℃ com tampa.
9.2.6Lavagem: Remova a tampa com cuidado e limpe o líquido dos poços e enxágue os micropoços com 250 µl de solução de lavagem diluída (solução3) em intervalos de 10s por 4-5 vezes.Absorver a água residual com papel absorvente (o resto da bolha de ar pode ser eliminado com ponta não utilizada).
9.2.7Adicionar conjugado enzimático: Adicione 100ml de solução de conjugado enzimático (kit fornecido) em cada poço, misture delicadamente e incube por 30min a 37℃ com tampa.Repita a etapa de lavagem novamente.
9.2.8Coloração: Adicionar 50µl de solução A(kit fornecido) e 50µl de solução B(kit fornecido) para cada poço.Misture delicadamente e incube por 15 minutos a 37 ℃ com tampa.
9.2.9Medir: Adicione 50µl da solução de parada (kit fornecido) para cada poço.Misture suavemente e meça a absorbância a 450 nm (sugerimos medir com o comprimento de onda duplo de 450/630 nm. Leia o resultado em 5 minutos após adicionar a solução de parada).
10. Resultados
10.1 Absorvância percentual
Os valores médios dos valores de absorbância obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorbância do primeiro padrão (padrão zero) e multiplicados por 100%.O padrão zero é assim igualado a 100% e os valores de absorbância são expressos em porcentagens.
B
Absorvância (%) = —— ×100%
B0
B ——padrão de absorbância (ou amostra)
B0 ——absorvância padrão zero
10.2 Curva Padrão
----Para desenhar uma curva padrão: Tome o valor de absorbância dos padrões como eixo y, semi logarítmico da concentração da solução padrão de tilosina (ppb) como eixo x.
----A concentração de tilosina de cada amostra (ppb), que pode ser lida na curva de calibração, é multiplicada pelo fator de diluição correspondente de cada amostra seguida, e a concentração real da amostra é obtida.
Observe:
software especial foi desenvolvido para análise de dados, que pode ser fornecido mediante solicitação.
11. Sensibilidade, exatidão e precisão
Sensibilidade do teste:1,5 ppb
Limite de detecção:
Tecido animal………………………….……………1,5 ppb Leite…………………………………………….....…..15ppb Precisão:
Tecido animal………………………………………80±15%
Leite…………………………………..……….……80±10%
Precisão:
O coeficiente de variação do kit ELISA é inferior a 10%.
12. Aviso
12.1 Os valores médios dos valores de absorbância obtidos para os padrões e as amostras serão reduzidos se os reagentes e amostras não forem regulados à temperatura ambiente (20-25℃).
12.2 Não permita que os micropoços sequem entre as etapas para evitar reprodutibilidade malsucedida e opere a próxima etapa imediatamente após bater no suporte de micropoços.
12.3 Agite cada reagente cuidadosamente antes de usar.
12.4 Mantenha sua pele longe da solução de parada, pois ela é de 0,5MH2SO4solução.
12.5 Não utilize os kits desatualizados.Não troque os reagentes de lotes diferentes, senão perderá a sensibilidade.
12.6 Mantenha os kits ELISA em 2-8℃, não congele.Sele as placas de micropoços de descanso. Evite a luz direta do sol durante todas as incubações.Recomenda-se cobrir as placas de microtitulação.
12.7 A solução de substrato deve ser abandonada se mudar de cor.Os reagentes podem ficar ruins se o valor de absorbância (450/630nm) do padrão zero for menor que 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 A reação de coloração precisa de 15 minutos após a adição da solução A e da solução B. E você pode prolongar os intervalos de tempo de incubação para 20 minutos ou mais se a cor for muito clara para ser determinada.Nunca ultrapasse 30min, pelo contrário, encurte o tempo de incubação adequadamente.
12.9 A temperatura de reação ideal é 37℃.Temperaturas mais altas ou mais baixas levarão a mudanças nos valores de sensibilidade e absorbância.
13. Armazenamento
Condição de armazenamento: 2-8 ℃.
Período de armazenamento: 12 meses.
