Kit di immunodosaggio enzimatico competitivo per l'analisi quantitativa della tilosina
Kit di immunodosaggio enzimatico competitivo per
Analisi quantitativa diTilosina
1. Contesto
Tilosinaè un antibiotico macrolide, che viene applicato principalmente come antibatterico e anti-micoplasma.Sono stati stabiliti LMR rigorosi poiché questo farmaco può portare a gravi effetti collaterali in alcuni gruppi.
Questo kit è un nuovo prodotto basato sulla tecnologia ELISA, che è veloce, facile, preciso e sensibile rispetto alle comuni analisi strumentali e richiede solo 1,5 ore in un'unica operazione, può ridurre notevolmente l'errore di operazione e l'intensità del lavoro.
2. Principio di prova
Questo kit si basa sulla tecnologia ELISA a competizione indiretta.I micropozzetti sono rivestiti con l'antigene di accoppiamento.Il residuo di tilosina nel campione compete con l'antigene rivestito sulla micropiastra per l'anticorpo.Dopo l'aggiunta dell'anticorpo marcato con enzima, viene utilizzato il substrato TMB per mostrare il colore.L'assorbanza del campione è correlata negativamente alla tilosina che risiede in esso, dopo il confronto con la curva standard, moltiplicata per il fattore di diluizione, è possibile calcolare la quantità di tilosina residua nel campione.
3. Applicazioni
Questo kit può essere utilizzato nell'analisi quantitativa e qualitativa dei residui di tilosina nei tessuti animali (pollo, maiale, anatra) e latte, miele, uova, ecc.
4. Reazioni incrociate
Tilosina………………………………………………..100%
Tilmicosina………………………………………………<2%
5. Materiali richiesti
5.1 Attrezzature:
----Spettrofotometro a piastra per microtitolazione (450nm/630nm)
----Evaporatore rotante o strumenti di essiccazione dell'azoto
----omogeneizzatore
----Shaker
----Centrifuga
---- Bilancia analitica (induttanza: 0,01 g)
---- Pipetta graduata: 10 ml
---- Bulbo pipetta in gomma
---- Pallone volumetrico: 10 ml
----Provette da centrifuga in polistirene: 50 ml
---- Micropipette: 20-200 ml, 100-1000 ml
250ml-multipipetta
5.2 Reagenti:
----Idrossido di sodio (NaOH, AR)
----Bicarbonato di sodio (NaHCO3,AR)
---- Carbonato di sodio (NaCO3, AR)
----Acido tricloroacetico (AR)
---- Acetonitrile (AR)
---- Acetato di etile (AR)
┅┅n-esano (AR)
----Acqua deionizzata
6. Componenti del kit
l Piastra per microtitolazione con 96 pozzetti rivestiti con antigene
l Soluzioni standard (5 flaconi, 1 ml/flacone)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Spiking controllo standard: (1 ml/flacone)1 ppm
l Enzima coniugato 1ml……………..…..…tappo rosso
l Soluzione anticorpale 7ml……………….……tappo verde
l Soluzione A 7ml…………………….….……tappo bianco
l Soluzione B 7ml...……………………………..tappo rosso
l Stop solution 7ml.……………….……….tappo giallo
l 20×soluzione di lavaggio concentrata 40ml
…………………………………..…tappo trasparente
l 4×soluzione di estrazione concentrata 50ml
……………………………………………….berretto blu
7. Preparazione dei reagenti:
Soluzione 1:Soluzione di NaOH 0,1 mol/L
Pesare 0,4 g di NaOH in 100 ml di acqua deionizzata e mescolare completamente.
Soluzione 2: soluzione di NaOH 1mol/L
Pesare 4 g di NaOH in 100 ml di acqua deionizzata e mescolare completamente.
Soluzione 3: Sale tampone carbonato
Soluzione1: 0,2 milioni di bilanci
Sciogliere 51,6 g di Na2HPO4·12H2O, 8,7 g di NaH2PO4·2H2O con acqua deionizzata e diluire a 1000 ml.
Soluzione2: Soluzione di estrazione
Diluire la soluzione di estrazione concentrata 2× con acqua deionizzata nel rapporto volumetrico di 1:1(ad esempio 10 ml di soluzione di estrazione 2× + 10 ml di acqua deionizzata), che sarà utilizzato per l'estrazione del campione,questa soluzione può essere conservata a 4℃ per 1 mese.
Soluzione3: Soluzione di lavaggio
Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 20× con acqua deionizzata nel rapporto volumetrico di 1:19(ad esempio 5 ml di soluzione di lavaggio 20× + 95 ml di acqua deionizzata), che servirà per lavare i piatti.Questa soluzione può essere conservata a 4℃ per 1 mese.
8. Preparazioni dei campioni
8.1 Avviso e precauzioni prima del funzionamento:
(a) Si prega di utilizzare punte una tantum nel processo di esperimento e cambiare le punte quando si assorbe un reagente diverso.
(b) Assicurarsi che tutti gli strumenti siano puliti.
(c) Conservare il campione di tessuto in congelatore.
(d) Il campione preparato deve essere utilizzato per l'analisi immediatamente.
8.2 Tessuto animale (pollo, maiale, ecc.)
----Omogeneizzare il campione con l'omogeneizzatore;
---- Prendere 2,0 ± 0,05 g di omogenato in una provetta da centrifuga in polistirene da 50 ml;aggiungere 2 ml di 0,2 M PB (soluzione1), agitare per sciogliere, quindi aggiungere 8 ml di acetato di etile e agitare energicamente per 3 minuti;
----Centrifuga per la separazione: 3000g/temperatura ambiente/5min.
----Trasferire 4 ml della fase organica supernatante in un tubo di vetro da 10 ml, asciugare con bagnomaria a 50-60 ℃ sotto flusso di azoto gassoso;
---- Sciogliere il residuo secco con 1 ml di n-esano, vortexare per 30 secondi per scioglierlo, quindi aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione (soluzione2), vortexare per 1 min.centrifuga per separazione: 3000g / temperatura ambiente / 5min
----Rimuovere la fase n-esano surnatante;prendere 50μl della fase acquosa del substrato per l'analisi.
Fattore di diluizione: 1
8.2 Latte
----Prendere 100μl di campione di latte crudo, mescolare con 900μl di soluzione di estrazione (soluzione2) e mescolare completamente.
----Prendere 50μl della soluzione preparata per l'analisi.
Fattore di diluizione: 10
9. Processo di analisi
9.1 Avviso prima del test
9.1.1Assicurarsi che tutti i reagenti e i micropozzetti siano tutti a temperatura ambiente (20-25 ℃).
9.1.2Riportare tutti gli altri reagenti a 2-8℃subito dopo l'uso.
9.1.3Il lavaggio corretto dei micropozzetti è un passaggio importante nel processo di analisi;è il fattore vitale per la riproducibilità dell'analisi ELISA.
9.1.4 Aannullare la luce e coprire i micropozzetti durante l'incubazione.
9.2 Fasi del test
9.2.1 Estrarre tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 ℃) per più di 30 minuti, agitare delicatamente prima dell'uso.
9.2.2 Estrarre i micropozzetti necessari e rimettere immediatamente il resto nel sacchetto con chiusura lampo a 2-8℃.
9.2.3 La soluzione di lavaggio diluita deve essere riscaldata a temperatura ambiente prima dell'uso.
9.2.4Numero:Le posizioni numerate di ogni micropozzetto e tutti gli standard ei campioni devono essere analizzati in duplicato.Registrare le posizioni degli standard e dei campioni.
9.2.5Add soluzione/campione standard e soluzione anticorpale: Aggiungere 50µl di soluzione standard((corredo fornito)) o il campione preparato nei pozzetti corrispondenti.Aggiungere 50 µl di soluzione anticorpale (corredo fornito).Mescolare delicatamente agitando manualmente la piastra e incubare per 30 minuti a 37°C con coperchio.
9.2.6Lavaggio: Rimuovere delicatamente il coperchio e purificare il liquido dai pozzetti e risciacquare i micropozzetti con 250 µl di soluzione di lavaggio diluita (soluzione3) a intervalli di 10 secondi per 4-5 volte.Assorbire l'acqua residua con carta assorbente (la bolla d'aria residua può essere eliminata con la punta inutilizzata).
9.2.7Aggiungi coniugato enzimatico: aggiungere 100 ml di soluzione di coniugato enzimatico (corredo fornito) in ciascun pozzetto, mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a 37℃ con coperchio.Ripeti di nuovo la fase di lavaggio.
9.2.8Colorazione: Aggiungere 50µl di soluzione A(corredo fornito) e 50µl di soluzione B(corredo fornito) a ciascun pozzetto.Mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a 37℃ con coperchio.
9.2.9Misurare: Aggiungere 50µl della soluzione di arresto (corredo fornito) a ciascun pozzetto.Miscelare delicatamente e misurare l'assorbanza a 450 nm (si consiglia di misurare con la doppia lunghezza d'onda di 450/630 nm. Leggere il risultato entro 5 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto).
10. Risultati
10.1 Assorbanza percentuale
I valori medi dei valori di assorbanza ottenuti per gli standard ei campioni vengono divisi per il valore di assorbanza del primo standard (standard zero) e moltiplicati per 100%.Lo standard zero è quindi reso uguale al 100% ei valori di assorbanza sono riportati in percentuale.
B
Assorbanza (%) = —— ×100%
B0
B ——standard di assorbanza (o campione)
B0 ——assorbanza zero standard
10.2 Curva standard
----Per tracciare una curva standard: Prendere il valore di assorbanza degli standard come asse y, semilogaritmico della concentrazione della soluzione standard di tilosina (ppb) come asse x.
----La concentrazione di tilosina di ciascun campione (ppb), che può essere letta dalla curva di calibrazione, viene moltiplicata per il corrispondente fattore di diluizione di ciascun campione seguito e si ottiene la concentrazione effettiva del campione.
Si prega di notare:
è stato sviluppato un software speciale per l'analisi dei dati, che può essere fornito su richiesta.
11. Sensibilità, accuratezza e precisione
Sensibilità del test:1,5ppb
Limite di rilevamento:
Tessuto animale………………………….……………1.5ppb Latte…………………………………………….....…..15ppb Precisione:
Tessuto animale…………………………...…………80±15%
Latte…………………………………..……….……80±10%
Precisione:
Il coefficiente di variazione del kit ELISA è inferiore al 10%.
12. Avviso
12.1 I valori medi dei valori di assorbanza ottenuti per gli standard e i campioni saranno ridotti se i reagenti e i campioni non sono stati regolati a temperatura ambiente (20-25 ℃).
12.2 Non lasciare asciugare i micropozzetti tra una fase e l'altra per evitare una riproducibilità non riuscita e passare alla fase successiva immediatamente dopo aver picchiettato il supporto per micropozzetti.
12.3 Agitare delicatamente ciascun reagente prima dell'uso.
12.4 Tenere la pelle lontana dalla soluzione di arresto perché è 0,5 MH2SO4soluzione.
12.5 Non utilizzare i kit scaduti.Non scambiare i reagenti di lotti diversi, altrimenti diminuirà la sensibilità.
12.6 Conservare i kit ELISA a 2-8℃, non congelare.Sigillare le piastre per micropozzetti, evitare la luce diretta del sole durante tutte le incubazioni.Si consiglia di coprire le micropiastre.
12.7 La soluzione del substrato dovrebbe essere abbandonata se vira i colori.I reagenti possono deteriorarsi se il valore di assorbanza (450/630nm) dello standard zero è inferiore a 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 La reazione di colorazione richiede 15 minuti dopo l'aggiunta della soluzione A e della soluzione B. E' possibile prolungare gli intervalli di tempo di incubazione a 20 minuti o più se il colore è troppo chiaro per essere determinato.Non superare mai i 30min, anzi accorciare adeguatamente il tempo di incubazione.
12.9 La temperatura di reazione ottimale è 37℃.Una temperatura più alta o più bassa porterà a cambiamenti dei valori di sensibilità e assorbanza.
13. Stoccaggio
Condizioni di conservazione: 2-8 ℃.
Periodo di conservazione: 12 mesi.
