Konkurētspējīgs enzīmu imūnanalīzes komplekts tilozīna kvantitatīvai analīzei
Konkurētspējīgs enzīmu imūnanalīzes komplekts
Kvantitatīvā analīzeTilozīns
1. Fons
Tilozīnsir makrolīdu antibiotika, ko galvenokārt izmanto kā antibakteriālu un pretmikoplazmas līdzekli.Ir noteikti stingri MRL, jo šīs zāles noteiktās grupās var izraisīt nopietnas blakusparādības.
Šis komplekts ir jauns produkts, kas balstīts uz ELISA tehnoloģiju, kas ir ātrs, vienkāršs, precīzs un jutīgs salīdzinājumā ar parasto instrumentālo analīzi un prasa tikai 1,5 stundas vienā operācijā, tas var ievērojami samazināt darbības kļūdu un darba intensitāti.
2. Testa princips
Šis komplekts ir balstīts uz netieši konkurējošu ELISA tehnoloģiju.Mikrotitra iedobes ir pārklātas ar savienojošo antigēnu.Tilozīna atlikums paraugā konkurē ar antigēnu, kas pārklāts uz mikrotitrēšanas plāksnes par antivielu.Pēc enzīmu iezīmētas anti-antivielas pievienošanas TMB substrātu izmanto, lai parādītu krāsu.Parauga absorbcija ir negatīvi saistīta ar tilozīna atlikumu tajā, pēc salīdzināšanas ar standarta līkni, reizinot ar atšķaidījuma koeficientu, var aprēķināt tilozīna atlieku daudzumu paraugā.
3. Pieteikumi
Šo komplektu var izmantot tilozīna atlieku kvantitatīvai un kvalitatīvai analīzei dzīvnieku audos (vistas, cūkgaļas, pīles) un piena, medus, olas utt.
4. Savstarpējas reakcijas
Tilozīns………………………………………………..100%
Tilmikozīns………………………………………………<2%
5. Nepieciešamie materiāli
5.1 Aprīkojums:
----Mikrotitra plates spektrofotometrs (450nm/630nm)
----Rotācijas iztvaicētājs vai slāpekļa žāvēšanas instrumenti
----homogenizators
----Šeikeris
----Centrifūga
----Analītiskie svari (induktivitāte: 0,01g)
----Pipete ar graduāciju: 10 ml
----Gumijas pipetes spuldze
----Mērkolba: 10ml
----Polistirola centrifūgas caurules: 50ml
----Mikropipetes: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multipipete
5.2. Reaģenti:
----Nātrija hidroksīds (NaOH, AR)
---- Nātrija bikarbonāts (NaHCO3,AR)
---- Nātrija karbonāts (NaCO3, AR)
---- trihloretiķskābe (AR)
---- Acetonitrils (AR)
----Etilacetāts (AR)
┅┅n-heksāns (AR)
----Dejonizēts ūdens
6. Komplekta sastāvdaļas
l Mikrotitrēšanas plāksne ar 96 iedobēm, kas pārklātas ar antigēnu
l Standarta šķīdumi (5 pudeles, 1 ml uz pudeli)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Standarta kontrole: (1 ml/pudele)1ppm
l Enzīmu konjugāts 1ml……………..……………………
l Antivielu šķīdums 7ml……………….……zaļš vāciņš
l Šķīdums A 7 ml……………………….……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
l Šķīdums B 7ml………………………………..sarkans vāciņš
l Stop šķīdums 7ml.……………….……….dzeltens vāciņš
l 20×koncentrēts mazgāšanas šķīdums 40ml
…………………………………..…caurspīdīgs vāciņš
l 4xkoncentrēts ekstrakcijas šķīdums 50ml
………………………………………………….zils vāciņš
7. Reaģentu sagatavošana:
1. risinājums:0,1 mol/l NaOH šķīdums
Nosver 0,4 g NaOH uz 100 ml dejonizēta ūdens un pilnībā samaisa.
2. risinājums: 1 mol/L NaOH šķīdums
Nosver 4 g NaOH uz 100 ml dejonizēta ūdens un pilnībā samaisa.
3. risinājums: Karbonāta bufera sāls
Risinājums1: 0,2 M PB
Izšķīdina 51,6 g Na2HPO4· 12h2O, 8,7 g NaH2PO4· 2H2O ar dejonizētu ūdeni un atšķaida līdz 1000 ml.
Risinājums2: ekstrakcijas šķīdums
Atšķaida 2x koncentrētu ekstrakcijas šķīdumu ar dejonizētu ūdeni tilpuma attiecībā 1:1 (piemēram, 10 ml 2 × ekstrakcijas šķīduma + 10 ml dejonizēta ūdens), ko izmantos paraugu ekstrakcijai,šo šķīdumu var uzglabāt 4℃ temperatūrā 1 mēnesi.
Risinājums3: mazgāšanas šķīdums
Atšķaida 20x koncentrētu mazgāšanas šķīdumu ar dejonizētu ūdeni tilpuma attiecībā 1:19 (piemēram, 5 ml 20x mazgāšanas šķīduma + 95 ml dejonizēta ūdens), kas tiks izmantots šķīvju mazgāšanai.Šo šķīdumu var uzglabāt 4℃ temperatūrā 1 mēnesi.
8. Paraugu sagatavošana
8.1 Paziņojums un piesardzības pasākumi pirms ekspluatācijas:
a) Eksperimenta laikā izmantojiet vienreizējus uzgaļus un mainiet uzgaļus, kad tiek absorbēts cits reaģents.
(b) Pārliecinieties, vai visi instrumenti ir tīri.
c) Glabājiet audu paraugu sasaldē.
d) Sagatavotais paraugs analīzei jāizmanto uzreiz.
8.2. Dzīvnieku audi (vistas, cūkgaļas utt.)
----Homogenizēt paraugu ar homogenizatoru;
----Ņem 2,0±0,05 g homogenāta 50 ml polistirola centrifūgas mēģenē;pievienojiet 2 ml 0,2 M PB (risinājums1), sakratiet, lai izšķīst, un pēc tam pievienojiet 8 ml etilacetāta un sīvi kratiet 3 minūtes;
----Centrifūga atdalīšanai: 3000g / apkārtējās vides temperatūra / 5min.
----Ieliet 4 ml supernatanta organiskās fāzes 10 ml stikla mēģenē, nosusiniet ar 50-60 ℃ ūdens vannu slāpekļa gāzes plūsmā;
---- Izšķīdiniet sauso pārpalikumu ar 1 ml n-heksāna, maisiet vorteksā 30 sekundes, lai izšķīdinātu, un pēc tam pievienojiet 1 ml ekstrakcijas šķīduma (risinājums2), virpiniet 1 minūti.centrifūga atdalīšanai: 3000g / apkārtējā temperatūra / 5min
----Noņemiet n-heksāna fāzi;analīzei ņem 50 μl substrāta ūdens fāzes.
Atšķaidīšanas koeficients: 1
8.2 Piens
----Ņem 100 μl svaigpiena parauga, sajauc ar 900 μl ekstrakcijas šķīduma (risinājums2) un pilnībā samaisa.
----Analīzei ņem 50 μl sagatavotā šķīduma.
Atšķaidīšanas koeficients: 10
9. Pārbaudes process
9.1. Brīdinājums pirms testa
9.1.1Pārliecinieties, vai visi reaģenti un mikroiedobes ir istabas temperatūrā (20-25 ℃).
9.1.2Atgrieziet visus pārējos reaģentus uz 2-8℃uzreiz pēc lietošanas.
9.1.3Mikroiedobumu pareiza mazgāšana ir svarīgs testa procesa posms;tas ir būtisks ELISA analīzes reproducējamības faktors.
9.1.4 Aiztukšojiet gaismu un inkubācijas laikā aizsedziet mikroiedobes.
9.2. Pārbaudes soļi
9.2.1. Izņemiet visus reaģentus istabas temperatūrā (20-25 ℃) ilgāk par 30 minūtēm, pirms lietošanas viegli sakratiet.
9.2.2 Nekavējoties izņemiet vajadzīgās mikroiedobes un pārējās ielieciet atpakaļ maisā ar rāvējslēdzēju 2–8 ℃ temperatūrā.
9.2.3. Pirms lietošanas atšķaidītais mazgāšanas šķīdums jāsasilda līdz istabas temperatūrai.
9.2.4Numurs:Numurētas katras mikroiedobes pozīcijas un visi standarti un paraugi ir jāpalaiž divos eksemplāros.Ierakstiet standartus un paraugu pozīcijas.
9.2.5Add standartšķīdums/paraugs un antivielu šķīdums: Pievienojiet 50 µl standartšķīduma ((komplekts nodrošināts)) vai sagatavotu paraugu atbilstošām iedobēm.Pievienojiet 50 µl antivielu šķīduma (komplekts nodrošināts).Viegli samaisiet, manuāli kratot plati, un inkubējiet 30 minūtes 37 ℃ ar vāku.
9.2.6Mazgāt: Uzmanīgi noņemiet vāku un iztīriet šķidrumu no iedobēm un izskalojiet mikroiedobes ar 250 µl atšķaidīta mazgāšanas šķīduma (risinājums3) ar intervālu 10s 4-5 reizes.Absorbējiet atlikušo ūdeni ar absorbējošu papīru (pārējo gaisa burbuli var likvidēt ar neizmantoto galu).
9.2.7Pievienojiet fermentu konjugātu: Pievienojiet 100 ml fermentu konjugāta šķīduma (komplekts nodrošināts) katrā iedobē, uzmanīgi samaisiet un inkubējiet 30 minūtes 37 ℃ ar vāku.Atkārtojiet mazgāšanas soli vēlreiz.
9.2.8Krāsojums: Pievienojiet 50 µl šķīduma A(komplekts nodrošināts) un 50 µl šķīduma B(komplekts nodrošināts) katrai iedobei.Viegli samaisiet un inkubējiet 15 minūtes 37 ℃ ar vāku.
9.2.9Mērs: Pievienojiet 50 µl apturēšanas šķīduma (komplekts nodrošināts) katrai iedobei.Viegli samaisiet un izmēra absorbciju pie 450 nm (Ieteicams izmērīt ar dubultviļņu garumu 450/630 nm. Izlasiet rezultātu 5 minūšu laikā pēc apturēšanas šķīduma pievienošanas).
10. Rezultāti
10.1 Procentuālā absorbcija
Standartiem un paraugiem iegūtās absorbcijas vērtību vidējās vērtības dala ar pirmā standarta absorbcijas vērtību (nulles standarts ) un reizina ar 100%.Tādējādi nulles standarts ir vienāds ar 100%, un absorbcijas vērtības ir norādītas procentos.
B
Absorbcija (%) = —— × 100%
B0
B — absorbcijas standarts (vai paraugs)
B0 — absorbcijas nulles standarts
10.2. Standarta līkne
----Lai uzzīmētu standarta līkni: Ņemiet standartu absorbcijas vērtību kā y asi, tilozīna standartšķīduma koncentrācijas (ppb) puslogaritmisko vērtību kā x asi.
----Tilozīna koncentrāciju katrā paraugā (ppb), ko var nolasīt no kalibrēšanas līknes, reizina ar katra parauga atbilstošo atšķaidījuma koeficientu, un iegūst parauga faktisko koncentrāciju.
Lūdzu, ievērojiet:
datu analīzei ir izstrādāta speciāla programmatūra, kuru var nodrošināt pēc pieprasījuma.
11. Jutīgums, precizitāte un precizitāte
Testa jutība:1,5 ppb
Atklāšanas ierobežojums:
Dzīvnieku audi…………………………………………1,5 ppb Piens …………………………………………………..15 ppb Precizitāte:
Dzīvnieku audi………………………………………80±15%
Piens…………………………………………………………80±10%
Precizitāte:
ELISA komplekta variācijas koeficients ir mazāks par 10%.
12. Paziņojums
12.1. Standartiem un paraugiem iegūtās absorbcijas vērtību vidējās vērtības tiks samazinātas, ja reaģenti un paraugi nav noregulēti līdz istabas temperatūrai (20-25℃).
12.2. Neļaujiet mikroiedobēm izžūt starp soļiem, lai izvairītos no neveiksmīgas reproducēšanas, un veiciet nākamo darbību uzreiz pēc tam, kad piesitiet mikrodobumu turētājam.
12.3 Pirms lietošanas katru reaģentu viegli sakratiet.
12.4. Sargājiet ādu no pieturas šķīduma, jo tas ir 0,5MH2SO4risinājums.
12.5. Neizmantojiet novecojušus komplektus.Nemainiet dažādu partiju reaģentus, pretējā gadījumā samazināsies jutība.
12.6 Glabājiet ELISA komplektus 2–8 ℃ temperatūrā, nesasaldējiet.Aizveriet atlikušās mikroiedobes plāksnes. Visu inkubāciju laikā izvairieties no tiešas saules gaismas.Ieteicams pārklāt mikrotitrēšanas plāksnes.
12.7. Pamatnes šķīdums ir jāatsakās, ja tas iekrāsojas.Reaģenti var kļūt slikti, ja nulles standarta absorbcijas vērtība (450/630 nm) ir mazāka par 0,5 (A450 nm < 0,5).
12.8. Krāsošanas reakcijai ir nepieciešamas 15 minūtes pēc šķīduma A un šķīduma B pievienošanas. Jūs varat pagarināt inkubācijas laiku līdz 20 minūtēm vai ilgāk, ja krāsa ir pārāk gaiša, lai to varētu noteikt.Nekad nepārsniedziet 30 minūtes, gluži pretēji, pareizi saīsiniet inkubācijas laiku.
12.9 Optimālā reakcijas temperatūra ir 37 ℃.Augstāka vai zemāka temperatūra izraisīs jutības un absorbcijas vērtību izmaiņas.
13. Glabāšana
Uzglabāšanas stāvoklis: 2-8℃.
Uzglabāšanas laiks: 12 mēneši.
