produk

1. Latar Belakang

Tylosinadalah antibiotik makrolida, yang terutama digunakan sebagai antibakteri dan anti-mikoplasma.MRL yang ketat telah ditetapkan karena obat ini dapat menyebabkan efek samping yang serius pada kelompok tertentu.

Kit ini adalah produk baru berdasarkan teknologi ELISA, yang cepat, mudah, akurat dan sensitif dibandingkan dengan analisis instrumental umum dan hanya membutuhkan 1,5 jam dalam satu operasi, dapat sangat meminimalkan kesalahan operasi dan intensitas kerja.

2. Uji Prinsip

Kit ini didasarkan pada teknologi ELISA persaingan tidak langsung.Sumur mikrotiter dilapisi dengan antigen kopling.Residu tylosin dalam sampel bersaing dengan antigen yang dilapisi pada pelat mikrotiter untuk mendapatkan antibodi.Setelah penambahan anti-antibodi berlabel enzim, substrat TMB digunakan untuk menunjukkan warna.Absorbansi sampel berhubungan negatif dengan tylosin yang berada di dalamnya, setelah membandingkan dengan Kurva Standar, dikalikan dengan faktor pengenceran, jumlah residu tylosin dalam sampel dapat dihitung.

3. Aplikasi

Kit ini dapat digunakan dalam analisis kuantitatif dan kualitatif residu tylosin pada jaringan hewan (ayam, babi, bebek) dan susu, madu, telur, dll.

4. Reaksi silang

Tylosin………………………………………………..100%

Tilmicosin………………………………………………………<2%

5. Bahan yang Dibutuhkan

5.1 Peralatan:

---- Spektrofotometer pelat mikrotiter (450nm/630nm)

---- Rotary evaporator atau instrumen pengering nitrogen

---- homogenizer

----Pengocok

---- Sentrifugal

---- Neraca analitik (induktansi: 0,01g)

---- Pipet lulus: 10ml

---- Bohlam pipet karet

---- Labu volumetrik: 10ml

---- Tabung centrifuge Polystyrene: 50ml

----Mikropipet: 20-200ml, 100-1000ml

250ml-multipipet

5.2 Reagen:

----Natrium hidroksida (NaOH, AR)

---- Natrium bikarbonat (NaHCO_3,AR)

---- Natrium karbonat (NaCO₃, AR)

---- Asam trikloroasetat (AR)

---- Asetonitril (AR)

----Etil asetat (AR)

┅┅n-Heksana (AR)

---- Air deionisasi

6. Komponen Kit

l Pelat mikrotiter dengan 96 sumur yang dilapisi dengan antigen

l Larutan standar (5 botol, 1ml/botol)

0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb

l Kontrol standar spiking: (1ml/botol)1ppm

l Enzyme conjugate 1ml……………..…..…topi merah

l Larutan antibodi 7ml……………….……tutup hijau

l Larutan A 7ml……………………….….……tutup putih

l Larutan B 7ml...………………………………..tutup merah

l Hentikan larutan 7ml.……………….……….tutup kuning

l 20×larutan pencuci pekat 40ml

…………………………………..…topi transparan

l 4×larutan ekstraksi pekat 50ml

……………………………………………….topi biru

7. Persiapan Reagen:

Solusi 1:larutan NaOH 0,1 mol/L

Timbang 0,4 g NaOH ke dalam 100 ml air deionisasi dan aduk rata.

Solusi 2: 1 mol/L larutan NaOH

Timbang 4g NaOH ke dalam 100ml air deionisasi dan aduk rata.

Solusi 3: Garam penyangga karbonat

Larutan1: 0,2M PB

Larutkan 51,6g Na₂HPO₄·12H₂O, 8,7g NaH₂PO₄·2H₂O dengan air deionisasi dan encerkan hingga 1000ml.

Larutan2: Solusi ekstraksi

Encerkan larutan ekstraksi pekat 2x dengan air deionisasi dengan perbandingan volume 1:1(misalnya 10ml larutan 2×ekstraksi + 10ml air deionisasi), yang akan digunakan untuk ekstraksi sampel,larutan ini dapat disimpan pada suhu 4℃ selama 1 bulan.

Larutan3: Larutan cuci

Encerkan larutan pencuci pekat 20×dengan air deionisasi dengan perbandingan volume 1:19(misalnya 5ml larutan pencuci 20x + 95ml air deionisasi), yang akan digunakan untuk mencuci piring.Larutan ini dapat disimpan pada suhu 4℃ selama 1 bulan.

8. Persiapan Sampel

8.1 Pemberitahuan dan tindakan pencegahan sebelum pengoperasian:

(a) Silakan gunakan tip satu kali dalam proses percobaan, dan ubah tip saat menyerap reagen yang berbeda.

(b) Pastikan semua instrumen bersih.

(c) Simpan sampel jaringan dalam keadaan beku.

(d) Sampel yang telah disiapkan harus digunakan untuk pengujian sekaligus.

8.2 Jaringan hewan (ayam, babi, dll)

---- Homogenkan sampel dengan homogenizer;

---- Ambil 2,0 ± 0,05 g homogenat ke dalam tabung centrifuge polystyrene 50ml;tambahkan 2ml 0,2M PB (larutan1) , kocok hingga larut, lalu tambahkan 8 ml etil asetat dan kocok kuat-kuat selama 3 menit;

---- Centrifuge untuk pemisahan: 3000g / suhu lingkungan / 5 menit.

---- Transfer 4ml fase organik supernatan ke dalam tabung gelas 10ml, keringkan dengan penangas air 50-60 ℃ di bawah aliran gas nitrogen;

---- Larutkan sisa kering dengan 1 ml n-heksana, vortex selama 30 detik hingga larut, lalu tambahkan 1 ml larutan ekstraksi (larutan2), vortex selama 1 menit.centrifuge untuk pemisahan: 3000g / suhu lingkungan / 5 menit

----Hapus fase n-heksana supernatan;ambil 50μl fase berair substrat untuk pengujian.

Faktor pengenceran: 1

8.2 Susu

----Ambil 100μl sampel susu mentah, campur dengan 900μl larutan ekstraksi (larutan2), dan aduk rata.

---- Ambil 50μl larutan yang disiapkan untuk pengujian.

Faktor pengenceran: 10

9. Proses pengujian

9.1 Pemberitahuan sebelum pengujian

9.1.1Pastikan semua reagen dan microwell berada pada suhu kamar (20-25℃).

9.1.2Kembalikan semua sisa reagen ke 2-8℃segera setelah digunakan.

9.1.3Mencuci microwell dengan benar merupakan langkah penting dalam proses pengujian;itu adalah faktor penting untuk reproduktifitas analisis ELISA.

9.1.4 Abatalkan cahaya dan tutupi microwell selama inkubasi.

9.2 Langkah Pengujian

9.2.1 Keluarkan semua reagen pada suhu kamar (20-25℃) selama lebih dari 30 menit, kocok perlahan sebelum digunakan.

9.2.2 Keluarkan microwell yang diperlukan dan segera kembalikan sisanya ke dalam kantong zip-lock pada suhu 2-8℃.

9.2.3 Larutan pencuci yang telah diencerkan harus dihangatkan kembali pada suhu kamar sebelum digunakan.

9.2.4Nomor:Bernomor setiap posisi microwell dan semua standar dan sampel harus dijalankan dalam rangkap dua.Catat standar dan posisi sampel.

9.2.5Add larutan standar/sampel dan larutan antibodi: Tambahkan 50µl larutan standar((kit disediakan)) atau menyiapkan sampel ke sumur yang sesuai.Tambahkan 50µl larutan antibodi (kit disediakan).Aduk perlahan dengan mengocok piring secara manual dan inkubasi selama 30 menit pada suhu 37℃ dengan penutup.

9.2.6Mencuci: Lepaskan penutup dengan lembut dan murnikan cairan dari sumur dan bilas sumur mikro dengan larutan pencuci encer 250µl (larutan3) dengan interval 10 detik selama 4-5 kali.Serap sisa air dengan kertas penyerap (sisa gelembung udara dapat dihilangkan dengan ujung yang tidak terpakai).

9.2.7Tambahkan konjugat enzim: Tambahkan 100ml larutan konjugat enzim (kit disediakan) ke masing-masing sumur, campur perlahan dan inkubasi selama 30 menit pada suhu 37℃ dengan penutup.Ulangi langkah mencuci lagi.

9.2.8Pewarnaan: Tambahkan 50µl larutan A(kit disediakan) dan 50µl larutan B(kit disediakan) ke masing-masing sumur.Aduk perlahan dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 37℃ dengan penutup.

9.2.9Ukuran: Tambahkan 50µl stop solution(kit disediakan) ke masing-masing sumur.Aduk perlahan dan ukur absorbansi pada 450nm (Disarankan mengukur dengan panjang gelombang ganda 450/630nm. Baca hasilnya dalam 5 menit setelah menambahkan stop solution).

10. Hasil

10.1 Persentase absorbansi

Nilai rata-rata dari nilai absorbansi yang diperoleh untuk standar dan sampel dibagi dengan nilai absorbansi standar pertama (standar nol) dan dikalikan dengan 100%.Standar nol dengan demikian dibuat sama dengan 100% dan nilai absorbansi dikutip dalam persentase.

B

Absorbansi (%) = —— ×100%

B0

B ——standar absorbansi (atau sampel)

B0 ——standar nol absorbansi

10.2 Kurva Standar

----Untuk menggambar kurva standar: Ambil nilai absorbansi standar sebagai sumbu y, semi logaritmik dari konsentrasi larutan standar tilosin (ppb) sebagai sumbu x.

---- Konsentrasi tylosin dari setiap sampel (ppb), yang dapat dibaca dari kurva kalibrasi, dikalikan dengan faktor Pengenceran yang sesuai dari setiap sampel yang diikuti, dan diperoleh konsentrasi sampel yang sebenarnya.

Harap perhatikan:

perangkat lunak khusus telah dikembangkan untuk analisis data, yang dapat disediakan berdasarkan permintaan.

11. Sensitivitas, akurasi dan presisi

Uji Sensitivitas:1,5ppb

Batas deteksi:

Jaringan hewan……………………….………………1.5ppb Susu……………………………………………………….....…..15ppb Ketepatan:

Jaringan hewan…………………………...…………80±15%

Susu………………………………………..……….……80±10%

Presisi:

Koefisien variasi kit ELISA kurang dari 10%.

12. Perhatikan

12.1 Nilai rata-rata nilai absorbansi yang diperoleh untuk standar dan sampel akan berkurang jika reagen dan sampel belum diatur ke suhu kamar (20-25℃).

12.2 Jangan biarkan sumur mikro mengering di antara langkah-langkah untuk menghindari reproduktifitas yang tidak berhasil dan operasikan langkah berikutnya segera setelah mengetuk penahan sumur mikro.

12.3 Kocok setiap reagen dengan lembut sebelum digunakan.

12.4 Jauhkan kulit Anda dari stop solution karena 0,5MH₂SO₄larutan.

12.5 Jangan gunakan kit yang sudah kadaluarsa.Jangan menukar reagen dari batch yang berbeda, atau sensitivitasnya akan turun.

12.6 Simpan kit ELISA pada suhu 2-8℃, jangan dibekukan.Seal rest microwell plate, Hindari sinar matahari langsung selama semua inkubasi.Menutup pelat mikrotiter dianjurkan.

12.7 Larutan substrat harus ditinggalkan jika berubah warna.Reagen dapat menjadi buruk jika nilai absorbansi (450/630nm) dari standar nol kurang dari 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Reaksi pewarnaan membutuhkan 15 menit setelah penambahan larutan A dan larutan B. Dan Anda dapat memperpanjang rentang waktu inkubasi hingga 20 menit atau lebih jika warnanya terlalu terang untuk ditentukan.Jangan pernah melebihi 30 menit, sebaliknya, persingkat waktu inkubasi dengan benar.

12.9 Suhu reaksi optimal adalah 37℃.Suhu yang lebih tinggi atau lebih rendah akan menyebabkan perubahan nilai sensitivitas dan absorbansi.

13. Penyimpanan

Kondisi penyimpanan: 2-8 ℃.

Masa penyimpanan: 12 bulan.