Competitive Enzyme Immunoassay Kit foar kwantitative analyze fan Tylosin
Competitive Enzyme Immunoassay Kit foar
Kwantitative analyze fanTylosin
1. Eftergrûn
Tylosinis in makrolide-antibiotika, dat benammen brûkt wurdt as antibakteriel en anty-mykoplasma.Strikte MRL's binne fêststeld sûnt dit medisyn kin liede ta serieuze side-effekten yn bepaalde groepen.
Dizze kit is in nij produkt basearre op ELISA-technology, dy't fluch, maklik, akkuraat en gefoelich is yn ferliking mei gewoane ynstrumintale analyse en allinich 1,5 oeren nedich is yn ien operaasje, it kin operaasjeflater en wurkintensiteit behoarlik minimalisearje.
2. Testprinsipe
Dizze kit is basearre op yndirekt-kompetitive ELISA-technology.De mikrotiterboarnen binne bedekt mei koppelingsantigen.Tylosin-residu yn 'e stekproef konkurrearret mei it antigeen bedekt op' e mikrotiterplaat foar it antykodym.Nei de tafoeging fan enzyme markearre anty-antibody, wurdt TMB-substraat brûkt om de kleur te sjen.Absorption fan 'e stekproef is negatyf besibbe oan' e tylosine dy't dêryn wenje, nei fergeliking mei de Standertkromme, fermannichfâldige mei de verdunningsfaktor, kin de kwantiteit fan tylosinresidinsje yn 'e stekproef wurde berekkene.
3. Applikaasjes
Dizze kit kin brûkt wurde yn kwantitative en kwalitative analyze fan tylosinresidu yn dierweefsel (kip, varkensvlees, ein) en molke, huning, aai, ensfh.
4. Cross-reaksjes
Tylosin………………………………………………..100%
Tilmicosin……………………………………………………… <2%
5. Materiaal nedich
5.1 Apparatuer:
---- Mikrotiterplaatspektrofotometer (450nm/630nm)
---- Rotary evaporator of stikstof drogen ynstruminten
----homogenisator
----Shaker
----Sentrifuge
---- Analytyske lykwicht (ynduktinsje: 0.01g)
---- Graduearre pipet: 10ml
---- Rubberen pipetbol
----Volumetryske fles: 10ml
----Polystyrene centrifuge buizen: 50ml
----Mikropipetten: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml multipipette
5.2 Reagentia:
----Natriumhydroxide (NaOH, AR)
---- Natriumbikarbonaat (NaHCO3,AR)
---- Natriumkarbonaat (NaCO3, AR)
---- Trichloroacetic acid (AR)
---- Acetonitrile (AR)
---- Ethylacetat (AR)
┅┅n-hexane (AR)
---- Deionisearre wetter
6. Kit Components
l Mikrotiterplaat mei 96 putten bedekt mei antigeen
l Standert oplossingen (5 flessen, 1 ml / flesse)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking standert kontrôle: (1ml / flesse)1 ppm
l Enzym konjugaat 1ml……………………………..… reade kap
l Antilichaam oplossing 7ml………………………………green dop
l Oplossing A 7ml………………………………….……witte kap
l Oplossing B 7ml………………………………………..read cap
l Stop oplossing 7ml……………………………….giele dop
l 20 × konsintrearre wask oplossing 40ml
…………………………………..…transparante kap
l 4 × konsintrearre ekstraksje oplossing 50ml
………………………………………….blauwe kap
7. Tarieding fan reagens:
Oplossing 1:0,1 mol/l NaOH oplossing
Weagje 0,4 g NaOH oant 100 ml deionisearre wetter en mingje folslein.
Oplossing 2: 1 mol/L NaOH oplossing
Weagje 4g NaOH oant 100ml deionisearre wetter en mingje folslein.
Oplossing 3: Carbonate buffer sâlt
Oplossing1: 0,2M PB
51,6 g Na oplosse2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O mei deionisearre wetter en ferwiderje oant 1000ml.
Oplossing2: Extraction oplossing
Ferwiderje de 2 × konsintrearre ekstraksjeoplossing mei deionisearre wetter yn 'e folumeferhâlding fan 1: 1 (bygelyks 10ml fan 2 × ekstraksje oplossing + 10ml fan deionized wetter), dy't sil wurde brûkt foar sample-ekstraksje,dizze oplossing kin wurde opslein by 4 ℃ foar 1 moanne.
Oplossing3: Waskje oplossing
Ferwiderje de 20 × konsintrearre waskoplossing mei deionisearre wetter yn 'e folumeferhâlding fan 1:19 (bygelyks 5ml fan 20×wash oplossing + 95ml fan deionized wetter), dy't brûkt wurde foar it waskjen fan de platen.Dizze oplossing kin wurde opslein by 4 ℃ foar 1 moanne.
8. Sample tariedings
8.1 Notysje en foarsoarchsmaatregels foar operaasje:
(a) Brûk asjebleaft ienmalige tips yn it proses fan it eksperimint, en feroarje de tips as jo ferskate reagens absorbearje.
(b) Soargje derfoar dat alle ynstruminten binne skjin.
(c) Hâld weefselmonster yn 'e frieze.
(d) Tariede sample moat tagelyk brûkt wurde foar assay.
8.2 Dierenweefsel (kip, varkensvlees, ensfh.)
---- Homogenize it stekproef mei homogenizer;
---- Nim 2,0 ± 0,05 g fan homogenate yn in 50ml polystyrene centrifuge tube;add 2ml fan 0.2M PB (oplossing1), skodzje om te ûntbinen, en foegje dan 8ml ethylacetat ta en skodzje fûl foar 3min;
----Sentrifuge foar skieding: 3000g / ambient temperatuer / 5min.
---- Transfer 4ml fan 'e supernatant organyske faze yn in 10ml glêzen buis, droech mei 50-60 ℃ wetterbad ûnder stikstofgasstream;
---- Los it droege oerbliuwsel op mei 1 ml n-hexaan, draai foar 30 sekonden om op te lossen, en foegje dan 1 ml ekstraksjeoplossing ta (oplossing2), draai foar 1 min.centrifuge foar skieding: 3000g / ambient temperatuer / 5min
---- Fuortsmite de supernatant n-hexane faze;nim 50μl fan it substraat aqueous faze foar assay.
Verdunningsfaktor: 1
8.2 molke
---- Nim 100 μl rau molkemonster, mingje mei 900 μl ekstraksjeoplossing (oplossing2), en mingje folslein.
---- Nim 50μl fan 'e taret oplossing foar assay.
Verdunningsfaktor: 10
9. Assay proses
9.1 Notysje foar assay
9.1.1Soargje derfoar dat alle reagents en mikrowellen allegear by keamertemperatuer (20-25 ℃) binne.
9.1.2Werom alle rest reagents werom nei 2-8℃fuortendaliks nei gebrûk.
9.1.3It korrekt waskjen fan de mikrowellen is in wichtige stap yn it proses fan assay;it is de fitale faktor foar de reprodusearberens fan 'e ELISA-analyse.
9.1.4 Aûntbrekke it ljocht en dekke de mikrowellen by ynkubaasje.
9.2 Assay Stappen
9.2.1 Nim alle reagents út by keamertemperatuer (20-25 ℃) foar mear as 30min, skodzje sêft foar gebrûk.
9.2.2 Krij de nedige mikrowellen út en bring de rest fuortendaliks werom yn 'e zip-lock tas op 2-8 ℃.
9.2.3 De verdunde wask oplossing moat wurde rewarmed te wêzen op keamertemperatuer foar gebrûk.
9.2.4Nûmer:Nûmere elke mikrowellposysjes en alle noarmen en samples moatte yn duplikaat wurde útfierd.Record de noarmen en samples posysjes.
9.2.5Add standert oplossing/sample en antibody oplossing: Add 50µl fan standert oplossing ((kit foarsjoen)) of taret monster oan oerienkommende putten.Foegje 50 µl antykodytoplossing ta (kit foarsjoen).Mingje sêft troch de plaat mei de hân te skodzjen en ynkubearje foar 30 minuten by 37 ℃ mei deksel.
9.2.6Waskje: Ferwiderje de dekking foarsichtich en reinigje de flüssigens út 'e putten en spielje de mikrowellen mei 250 µl verdunde waskoplossing (oplossing3) mei ynterval fan 10s foar 4-5 kear.Absorbearje it oerbliuwende wetter mei absorberend papier (de rest luchtbel kin wurde eliminearre mei net brûkte tip).
9.2.7Foegje enzyme konjugaat ta: Add 100ml fan enzyme konjugaat oplossing (kit foarsjoen) oan elke put, mingje foarsichtich en ynkubearje foar 30 minuten by 37 ℃ mei deksel.Werhelje de waskstap wer.
9.2.8Coloration: Foegje 50 µl oplossing A (kit foarsjoen) en 50 µl oplossing B(kit foarsjoen) oan elke put.Mingje sêft en ynkubearje foar 15 minuten by 37 ℃ mei deksel.
9.2.9Mjitte: Foegje 50 µl fan de stopoplossing ta (kit foarsjoen) oan elke put.Mingje sêft en mjit de absorption by 450nm (It wurdt oanrikkemandearre maatregel mei de dûbele golflingte fan 450/630nm. Lês it resultaat binnen 5min nei it tafoegjen fan stopoplossing).
10. Resultaten
10.1 Persintaazje absorbance
De gemiddelde wearden fan 'e absorbânsjewearden krigen foar de noarmen en de samples wurde dield troch de absorbânsjewearde fan' e earste standert (nulstandert) en fermannichfâldige mei 100%.De nulstandert wurdt dus gelyk makke oan 100% en de absorbânsjewearden wurde oanhelle yn persintaazjes.
B
Absorbânsje (%) = —— ×100%
B0
B - Absorbânsje standert (as sample)
B0 ——absorbance nul standert
10.2 Standert Curve
---- Om in standert kromme te tekenjen: Nim de absorbânsjewearde fan noarmen as y-as, semi-logaritmysk fan 'e konsintraasje fan' e tylosine-standertoplossing (ppb) as x-as.
---- De tylosine-konsintraasje fan elke stekproef (ppb), dy't kin wurde lêzen út 'e kalibraasjekromme, wurdt fermannichfâldige mei de oerienkommende Verdunningsfaktor fan elke sample folge, en de eigentlike konsintraasje fan 'e stekproef wurdt krigen.
Let op:
spesjale software is ûntwikkele foar gegevens analyze, dat kin wurde levere op oanfraach.
11. Gefoelichheid, krektens en krektens
Testsensitiviteit:1,5ppb
Deteksjelimyt:
Dierlike weefsel……………………………….………………1.5ppb Molke…………………………………………………………………..15ppb Krektens:
Dierlik weefsel………………………………………………80±15%
Molke……………………………………………………………….. 80±10%
Krektens:
Fariaasjekoëffisjint fan 'e ELISA-kit is minder dan 10%.
12. Notysje
12.1 De gemiddelde wearden fan 'e absorbânsjewearden krigen foar de noarmen en de samples sille wurde fermindere as de reagentia en samples net binne regele op keamertemperatuer (20-25 ℃).
12.2 Lit mikrowellen net droegje tusken stappen om mislearre reprodusearberens te foarkommen en operearje de folgjende stap direkt nei't de mikrowellhâlder tapast is.
12.3 Shake elk reagens sêft foar gebrûk.
12.4 Hâld dyn hûd fuort fan de stop oplossing foar it is 0.5MH2SO4oplossing.
12.5 Brûk de kits net ferâldere.Wissel de reagenzjes fan ferskate batches net út, oars sil it de gefoelichheid sakje.
12.6 Hâld de ELISA-kits op 2-8 ℃, net befrieze.Seal rest microwell platen, Avoid rjocht sinneljocht tidens alle incubations.It is oan te rieden om de mikrotiterplaten te dekken.
12.7 Substraatoplossing moat wurde ferlitten as it kleuren feroaret.De reagenzjes kinne ferkeard wurde as de absorbânsjewearde (450/630nm) fan 'e nulstandert minder is dan 0.5 (A450nm <0.5).
12.8 De kleurreaksje nedich 15min nei de tafoeging fan oplossing A en oplossing B. En jo kinne de ynkubaasjetiid berikke oant 20min of mear as de kleur te ljocht is om te bepalen.Nea boppe 30min, krekt oarsom, koarter de incubation tiid goed.
12.9 De optimale reaksjetemperatuer is 37 ℃.Hegere of legere temperatuer sil liede ta feroaringen fan gefoelichheid en absorbance wearden.
13. Opslach
Opslach betingst: 2-8 ℃.
Opslach perioade: 12 moannen.
