Kit d'immunodosage enzymatique compétitif pour l'analyse quantitative de la tylosine
Kit d'immunodosage enzymatique compétitif pour
Analyse quantitative deTylosine
1. Origines
Tylosineest un antibiotique macrolide, qui est principalement appliqué comme antibactérien et anti-mycoplasme.Des LMR strictes ont été établies car ce médicament peut entraîner des effets secondaires graves dans certains groupes.
Ce kit est un nouveau produit basé sur la technologie ELISA, qui est rapide, facile, précis et sensible par rapport à l'analyse instrumentale courante et ne nécessite que 1,5 heure en une seule opération, il peut considérablement minimiser les erreurs d'opération et l'intensité du travail.
2. Principe d'essai
Ce kit est basé sur la technologie ELISA indirecte compétitive.Les puits de microtitration sont recouverts d'antigène de couplage.Le résidu de tylosine dans l'échantillon entre en compétition avec l'antigène déposé sur la plaque de microtitration pour l'anticorps.Après l'ajout de l'anti-anticorps marqué par une enzyme, le substrat TMB est utilisé pour montrer la couleur.L'absorbance de l'échantillon est négativement liée à la tylosine qu'il contient, après comparaison avec la courbe standard, multipliée par le facteur de dilution, la quantité de résidus de tylosine dans l'échantillon peut être calculée.
3. Candidatures
Ce kit peut être utilisé dans l'analyse quantitative et qualitative des résidus de tylosine dans les tissus animaux (poulet, porc, canard) et le lait, le miel, l'œuf, etc.
4. Réactions croisées
Tylosine………………………………………………………..100%
Tilmicosine…………………………………………………<2%
5. Matériel requis
5.1 Équipements :
---- Spectrophotomètre à plaque de microtitration (450 nm/630 nm)
---- Évaporateur rotatif ou instruments de séchage à l'azote
----homogénéisateur
----Mixeur
----Centrifuger
----Balance analytique (inductance : 0,01 g)
----Pipette graduée : 10ml
----Poire de pipette en caoutchouc
----Fiole jaugée : 10ml
----Tubes à centrifuger en polystyrène : 50 ml
----Micropipettes : 20-200 ml, 100-1000 ml
250ml-multipipette
5.2 Réactifs :
----Hydroxyde de sodium (NaOH, AR)
----Bicarbonate de sodium (NaHCO3,AR)
---- Carbonate de sodium (NaCO3, AR)
----Acide trichloracétique (AR)
---- Acétonitrile (AR)
----Acétate d'éthyle (AR)
┅┅n-hexane (AR)
----Eau déminéralisée
6. Composants du kit
l Plaque de microtitration à 96 puits revêtus d'antigène
l solutions standard (5 bouteilles, 1 ml/bouteille)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Contrôle standard de dopage : (1 ml/bouteille)1ppm
l Conjugué enzymatique 1ml……………..…..…bouchon rouge
l Solution d'anticorps 7ml……………….……bouchon vert
l Solution A 7ml……………………….….……bouchon blanc
l Solution B 7ml...……………………………..capuchon rouge
l Solution d'arrêt 7ml.……………….……….capuchon jaune
l 20×solution de lavage concentrée 40ml
…………………………………..…bouchon transparent
l 4 × solution d'extraction concentrée 50 ml
……………………………………………….casquette bleue
7. Préparation des réactifs :
Solution 1 :Solution de NaOH à 0,1 mol/L
Pesez 0,4 g de NaOH pour 100 ml d'eau déminéralisée et mélangez complètement.
solution 2: Solution de NaOH 1mol/L
Pesez 4 g de NaOH pour 100 ml d'eau déminéralisée et mélangez complètement.
solution 3: Sel tampon carbonaté
La solution1 : 0,2 M PB
Dissoudre 51,6 g de Na2HPO4·12H2O, 8,7 g de NaH2PO4·2H2O avec de l'eau déminéralisée et diluer à 1000 ml.
La solution2 : Solution d'extraction
Diluer la solution d'extraction concentrée 2× avec de l'eau déminéralisée dans un rapport volumique de 1:1(par exemple 10 ml de solution d'extraction 2× + 10 ml d'eau déminéralisée), qui sera utilisé pour l'extraction d'échantillons,cette solution peut être stockée à 4℃ pendant 1 mois.
La solution3 : Solution de lavage
Diluer la solution de lavage concentrée 20× avec de l'eau déminéralisée dans un rapport volumique de 1:19(par exemple 5 ml de solution de lavage 20× + 95 ml d'eau déminéralisée), qui servira au lavage des assiettes.Cette solution peut être stockée à 4℃ pendant 1 mois.
8. Préparations d'échantillons
8.1 Avis et précautions avant utilisation :
(a) Veuillez utiliser des embouts uniques dans le processus d'expérience et changer les embouts lorsque vous absorbez un réactif différent.
(b) Assurez-vous que tous les instruments sont propres.
(c) Gardez l'échantillon de tissu au congélateur.
(d) L'échantillon préparé doit être utilisé immédiatement pour le dosage.
8.2 Tissus animaux (poulet, porc, etc.)
---- Homogénéiser l'échantillon avec un homogénéisateur ;
----Prendre 2,0 ± 0,05 g d'homogénat dans un tube à centrifuger en polystyrène de 50 ml ;ajouter 2ml de 0.2M PB (la solution1) , agitez pour dissoudre, puis ajoutez 8 ml d'acétate d'éthyle et agitez vigoureusement pendant 3 minutes ;
----Centrifugeuse pour séparation : 3000g / température ambiante / 5min.
----Transférer 4 ml de la phase organique surnageante dans un tube en verre de 10 ml, sécher avec un bain-marie à 50-60 ℃ sous un courant d'azote gazeux ;
---- Dissoudre les restes secs avec 1 ml de n-hexane, vortexer pendant 30 secondes pour dissoudre, puis ajouter 1 ml de solution d'extraction (la solution2), vortexer pendant 1 min.centrifugeuse pour séparation : 3000g / température ambiante / 5min
----Retirer la phase n-hexane surnageante ;prélever 50μl de la phase aqueuse du substrat pour le dosage.
Facteur de dilution : 1
8.2 Lait
----Prendre 100μl d'échantillon de lait cru, mélanger avec 900μl de solution d'extraction (la solution2), et mélanger complètement.
----Prendre 50μl de la solution préparée pour le dosage.
Facteur de dilution : 10
9. Processus de dosage
9.1 Avis avant dosage
9.1.1Assurez-vous que tous les réactifs et micropuits sont tous à température ambiante (20-25℃).
9.1.2Remettez tous les réactifs restants à 2-8℃immédiatement après utilisation.
9.1.3Le lavage correct des micropuits est une étape importante du processus de dosage ;c'est le facteur essentiel de la reproductibilité de l'analyse ELISA.
9.1.4 Unvider la lumière et couvrir les micropuits pendant l'incubation.
9.2 Étapes du dosage
9.2.1 Retirez tous les réactifs à température ambiante (20-25℃) pendant plus de 30 minutes, secouez doucement avant utilisation.
9.2.2 Sortez les micropuits nécessaires et remettez le reste dans le sac à fermeture éclair à 2-8℃ immédiatement.
9.2.3 La solution de lavage diluée doit être réchauffée à température ambiante avant utilisation.
9.2.4Nombre:Chaque position de micropuits est numérotée et tous les étalons et échantillons doivent être analysés en double.Enregistrez les positions des étalons et des échantillons.
9.2.5Add solution standard/échantillon et solution d'anticorps: Ajouter 50µl de solution étalon((kit fourni)) ou l'échantillon préparé dans les puits correspondants.Ajouter 50µl de solution d'anticorps(kit fourni).Mélangez doucement en secouant la plaque manuellement et incubez pendant 30 min à 37℃ avec couvercle.
9.2.6Laver: Retirez délicatement le couvercle et purifiez le liquide des puits et rincez les micropuits avec 250 µl de solution de lavage diluée (la solution3) à intervalle de 10 s pendant 4 à 5 fois.Absorbez l'eau résiduelle avec du papier absorbant (la bulle d'air restante peut être éliminée avec un embout non utilisé).
9.2.7Ajouter le conjugué enzymatique: Ajouter 100 ml de solution de conjugué enzymatique(kit fourni) à chaque puits, mélanger délicatement et incuber pendant 30min à 37℃ avec couvercle.Répétez l'étape de lavage à nouveau.
9.2.8Coloration: Ajouter 50µl de solution A(kit fourni) et 50µl de solution B(kit fourni) à chaque puits.Mélangez doucement et incubez pendant 15 minutes à 37℃ avec couvercle.
9.2.9Mesure: Ajouter 50µl de la solution d'arrêt(kit fourni) à chaque puits.Mélangez doucement et mesurez l'absorbance à 450 nm (il est suggéré de mesurer avec la double longueur d'onde de 450/630 nm. Lisez le résultat dans les 5 minutes après l'ajout de la solution d'arrêt).
10. Résultats
10.1 Pourcentage d'absorbance
Les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues pour les étalons et les échantillons sont divisées par la valeur d'absorbance du premier étalon (étalon zéro) et multipliées par 100 %.L'étalon zéro est ainsi rendu égal à 100 % et les valeurs d'absorbance sont indiquées en pourcentages.
B
Absorbance (%) = —— ×100%
B0
B ——étalon d'absorbance (ou échantillon)
B0 ——étalon zéro d'absorbance
10.2 Courbe standard
----Pour tracer une courbe standard : prendre la valeur d'absorbance des standards comme axe y, semi-logarithmique de la concentration de la solution standard de tylosine (ppb) comme axe x.
----La concentration de tylosine de chaque échantillon (ppb), qui peut être lue à partir de la courbe d'étalonnage, est multipliée par le facteur de dilution correspondant de chaque échantillon suivi, et la concentration réelle de l'échantillon est obtenue.
Veuillez noter :
un logiciel spécial a été développé pour l'analyse des données, qui peut être fourni sur demande.
11. Sensibilité, exactitude et précision
Sensibilité du test :1,5 ppb
Limite de détection:
Tissu animal……………………………………………1.5ppb Lait…………………………………………….....…..15ppb Précision:
Tissus animaux…………………...…………80±15%
Lait…………………………………..……….……80±10%
Précision:
Le coefficient de variation du kit ELISA est inférieur à 10 %.
12. Avis
12.1 Les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues pour les standards et les échantillons seront réduites si les réactifs et les échantillons n'ont pas été régulés à température ambiante (20-25℃).
12.2 Ne laissez pas les micropuits sécher entre les étapes pour éviter une mauvaise reproductibilité et effectuez l'étape suivante immédiatement après avoir tapoté le porte-micropuits.
12.3 Agiter doucement chaque réactif avant utilisation.
12.4 Gardez votre peau à l'écart de la solution d'arrêt car elle est de 0,5 MH2SO4la solution.
12.5 Ne pas utiliser les kits périmés.N'échangez pas les réactifs de différents lots, sinon cela diminuera la sensibilité.
12.6 Conserver les kits ELISA à 2-8℃, ne pas congeler.Scellez les plaques de micropuits restantes, évitez la lumière directe du soleil pendant toutes les incubations.Il est recommandé de couvrir les plaques de microtitration.
12.7 La solution de substrat doit être abandonnée si elle change de couleur.Les réactifs peuvent devenir mauvais si la valeur d'absorbance (450/630nm) de l'étalon zéro est inférieure à 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 La réaction de coloration nécessite 15 minutes après l'ajout de la solution A et de la solution B. Et vous pouvez prolonger les plages de temps d'incubation à 20 minutes ou plus si la couleur est trop claire pour être déterminée.Ne jamais dépasser 30min, au contraire, raccourcir correctement le temps d'incubation.
12.9 La température de réaction optimale est de 37℃.Une température plus élevée ou plus basse entraînera des modifications des valeurs de sensibilité et d'absorbance.
13. Stockage
Condition de stockage : 2-8℃.
Durée de stockage : 12 mois.
