Komplet za konkurenčni encimski imunski test za kvantitativno analizo tilozina
Komplet za kompetitivni encimski imunski test
Kvantitativna analizaTilozin
1. Ozadje
Tilozinje makrolidni antibiotik, ki se v glavnem uporablja kot antibakterijski in proti mikoplazmi.Določene so bile stroge MRL, saj lahko to zdravilo pri določenih skupinah povzroči resne stranske učinke.
Ta komplet je nov izdelek, ki temelji na tehnologiji ELISA, ki je hitra, enostavna, natančna in občutljiva v primerjavi z običajnimi instrumentalnimi analizami in potrebuje samo 1,5 ure v eni operaciji, kar lahko znatno zmanjša napake pri delovanju in intenzivnost dela.
2. Načelo preskusa
Ta komplet temelji na posredno-konkurenčni tehnologiji ELISA.Mikrotitrske vdolbinice so prekrite s sklopitvenim antigenom.Ostanek tilozina v vzorcu tekmuje z antigenom, prevlečenim na mikrotitrski plošči, za protitelo.Po dodatku encimsko označenega protitelesa se za prikaz barve uporabi substrat TMB.Absorbanca vzorca je negativno povezana z vsebnostjo tilozina v njem; po primerjavi s standardno krivuljo, pomnoženo s faktorjem redčenja, je mogoče izračunati količino ostanka tilozina v vzorcu.
3. Aplikacije
Ta komplet se lahko uporablja za kvantitativno in kvalitativno analizo ostankov tilozina v živalskem tkivu (piščanec, svinjina, raca) in mleku, medu, jajcih itd.
4. Navzkrižne reakcije
Tilozin………………………………………………..100 %
Tilmikozin………………………………………………<2 %
5. Potrebni materiali
5.1 Oprema:
---- Spektrofotometer za mikrotitrsko ploščo (450nm/630nm)
---- Rotacijski uparjalnik ali instrumenti za sušenje z dušikom
----homogenizator
----Shaker
----centrifuga
---- Analitična tehtnica (induktivnost: 0,01 g)
---- Graduirana pipeta: 10 ml
---- Gumijasta pipeta
---- Merilna bučka: 10 ml
---- Polistirenske centrifugalne epruvete: 50 ml
----Mikropipete: 20-200 ml, 100-1000 ml
250 ml-multipipeta
5.2 Reagenti:
----Natrijev hidroksid (NaOH, AR)
---- Natrijev bikarbonat (NaHCO3,AR)
---- Natrijev karbonat (NaCO3, AR)
----trikloroocetna kislina (AR)
---- Acetonitril (AR)
---- Etil acetat (AR)
┅┅n-heksan (AR)
----Deionizirana voda
6. Sestavni deli kompleta
l Mikrotiterska plošča s 96 jamicami, prevlečenimi z antigenom
l Standardne raztopine (5 steklenic, 1 ml/steklenico)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Standardna kontrola: (1 ml/stekleničko)1ppm
l Encimski konjugat 1 ml……………..…..…rdeča kapica
l Raztopina protiteles 7 ml……………….……zelena kapica
l Raztopina A 7 ml…………………….….……bela kapica
l Raztopina B 7 ml...……………………………..rdeči pokrovček
l Stop raztopina 7 ml.……………….……….rumena kapica
l 20×koncentrirana raztopina za pranje 40 ml
…………………………………..…prozoren pokrovček
l 4×koncentrirana ekstrakcijska raztopina 50ml
……………………………………………….modra kapica
7. Priprava reagentov:
1. rešitev:0,1 mol/L raztopina NaOH
Odtehtajte 0,4 g NaOH v 100 ml deionizirane vode in popolnoma premešajte.
Rešitev 2: 1 mol/L raztopina NaOH
Odtehtajte 4 g NaOH v 100 ml deionizirane vode in popolnoma premešajte.
Rešitev 3: Karbonatna puferska sol
rešitev1: 0,2M PB
Raztopite 51,6 g Na2HPO4· 12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O z deionizirano vodo in razredčite na 1000 ml.
rešitev2: Raztopina za ekstrakcijo
2× koncentrirano ekstrakcijsko raztopino razredčite z deionizirano vodo v volumskem razmerju 1:1(npr. 10 ml 2× ekstrakcijske raztopine + 10 ml deionizirane vode), ki bo uporabljen za ekstrakcijo vzorcev,to raztopino lahko hranite pri 4 ℃ 1 mesec.
rešitev3: Raztopina za pranje
20× koncentrirano raztopino za pranje razredčite z deionizirano vodo v volumskem razmerju 1:19(npr. 5 ml 20×pralne raztopine + 95 ml deionizirane vode), ki se bo uporabljal za pomivanje krožnikov.To raztopino lahko hranite pri 4 ℃ 1 mesec.
8. Priprava vzorcev
8.1 Obvestilo in previdnostni ukrepi pred uporabo:
(a) Med poskusom uporabite enkratne konice in jih zamenjajte, ko absorbirate drugačen reagent.
(b) Prepričajte se, da so vsi instrumenti čisti.
(c) Vzorec tkiva hranite v zamrzovalniku.
(d) Pripravljen vzorec je treba takoj uporabiti za analizo.
8.2 Živalsko tkivo (piščanec, svinjina itd.)
----Homogenizirajte vzorec s homogenizatorjem;
----Vzemite 2,0±0,05 g homogenata v 50 ml polistirensko epruveto za centrifugo;dodajte 2 ml 0,2 M PB (rešitev1), pretresite, da se raztopi, nato dodajte 8 ml etil acetata in močno stresajte 3 minute;
----Centrifuga za ločevanje: 3000 g / temperatura okolice / 5 min.
---- 4 ml supernatantne organske faze prenesite v 10 ml stekleno epruveto, posušite z vodno kopeljo pri 50-60 °C pod tokom plinastega dušika;
---- Suhi ostanek raztopite z 1 ml n-heksana, vrtinčite 30 s, da se raztopi, in nato dodajte 1 ml ekstrakcijske raztopine (rešitev2), vrtinčimo 1 minuto.centrifuga za ločevanje: 3000g / temperatura okolice / 5min
----Odstranite supernatant n-heksanske faze;za analizo vzemite 50 μl vodne faze substrata.
Faktor redčenja: 1
8.2 Mleko
---- Vzemite 100 μl vzorca surovega mleka, zmešajte z 900 μl raztopine za ekstrakcijo (rešitev2) in popolnoma premešajte.
---- Vzemite 50 μl pripravljene raztopine za analizo.
Faktor redčenja: 10
9. Postopek testiranja
9.1 Opozorilo pred analizo
9.1.1Prepričajte se, da so vsi reagenti in mikrovdolbinice na sobni temperaturi (20–25 ℃).
9.1.2Vse preostale reagente vrnite na 2-8℃takoj po uporabi.
9.1.3Pravilno pranje mikrovdolbinic je pomemben korak v procesu analize;je ključni dejavnik za ponovljivost analize ELISA.
9.1.4 Aizpraznite svetlobo in pokrijte mikrovdolbinice med inkubacijo.
9.2 Koraki preizkusa
9.2.1 Vse reagente vzemite ven pri sobni temperaturi (20-25 ℃) za več kot 30 minut, pred uporabo nežno pretresite.
9.2.2 Vzemite potrebne mikrovdolbinice in takoj vrnite preostanek v vrečko z zadrgo pri 2–8 ℃.
9.2.3 Razredčeno raztopino za izpiranje je treba pred uporabo ponovno segreti na sobno temperaturo.
9.2.4številka:Oštevilčite vse položaje mikrovdolbinic in vse standarde ter vzorce je treba izvesti v dvojniku.Zabeležite položaje standardov in vzorcev.
9.2.5Add standardna raztopina/vzorec in raztopina protiteles: Dodajte 50 µl standardne raztopine ((priložen komplet)) ali pripravljen vzorec v ustrezne vdolbinice.Dodajte 50 µl raztopine protiteles (priložen komplet).Nežno premešajte z ročnim stresanjem plošče in inkubirajte 30 minut pri 37 °C s pokrovom.
9.2.6Operite: Nežno odstranite pokrov in očistite tekočino iz vdolbinic ter sperite mikrovdolbinice z 250 µl razredčene raztopine za izpiranje (rešitev3) v intervalu 10 s 4-5 krat.Preostalo vodo popivnajte z vpojnim papirjem (ostali zračni mehurček lahko odstranite z neuporabljeno konico).
9.2.7Dodajte encimski konjugat: dodajte 100 ml raztopine encimskega konjugata (priložen komplet) v vsako vdolbinico, nežno premešajte in inkubirajte 30 minut pri 37 ℃ s pokrovom.Ponovno ponovite korak pranja.
9.2.8Obarvanost: Dodajte 50 µl raztopine A (priložen komplet) in 50 µl raztopine B(priložen komplet) v vsako vdolbinico.Nežno premešajte in inkubirajte 15 minut pri 37 ℃ s pokrovom.
9.2.9Izmeri: dodajte 50 µl stop raztopine (priložen komplet) v vsako vdolbinico.Previdno premešajte in izmerite absorbanco pri 450 nm (priporočljivo je merjenje z dvojno valovno dolžino 450/630 nm. Odčitajte rezultat v 5 minutah po dodajanju stop raztopine).
10. Rezultati
10.1 Odstotek absorbance
Srednje vrednosti vrednosti absorbance, dobljene za standarde in vzorce, se delijo z vrednostjo absorbance prvega standarda (ničelni standard) in pomnožijo s 100 %.Ničelni standard je tako enak 100 %, vrednosti absorbance pa so navedene v odstotkih.
B
Absorbanca (%) = —— ×100 %
B0
B ——standard absorpcije (ali vzorec)
B0 ——standard absorpcije nič
10.2 Standardna krivulja
----Za risanje standardne krivulje: vzemite vrednost absorbance standardov kot os y, pol logaritem koncentracije standardne raztopine tilozina (ppb) kot os x.
---- Koncentracija tilozina v vsakem vzorcu (ppb), ki jo je mogoče prebrati iz umeritvene krivulje, se pomnoži z ustreznim faktorjem redčenja vsakega vzorca, ki mu sledi, in dobi se dejanska koncentracija vzorca.
Upoštevajte:
Za analizo podatkov je bila razvita posebna programska oprema, ki je na voljo na zahtevo.
11. Občutljivost, točnost in natančnost
Testna občutljivost:1,5 ppb
Meja zaznavanja:
Živalsko tkivo………………………….……………1,5 ppb Mleko…………………………………………….....…..15 ppb Natančnost:
Živalsko tkivo…………………………………………80±15%
Mleko……………………………………..……….……80±10%
Natančnost:
Koeficient variacije kompleta ELISA je manjši od 10 %.
12. Obvestilo
12.1 Srednje vrednosti vrednosti absorbance, dobljene za standarde in vzorce, bodo zmanjšane, če reagenti in vzorci niso bili uravnani na sobno temperaturo (20-25 ℃).
12.2 Ne dovolite, da se mikrovdolbinice posušijo med koraki, da preprečite neuspešno ponovljivost, in zaženite naslednji korak takoj po dotiku držala mikrovdolbinic.
12.3 Vsak reagent pred uporabo nežno pretresite.
12.4 Kožo ne približujte stop raztopini, saj je 0,5 MH2SO4rešitev.
12.5 Ne uporabljajte zastarelih kompletov.Ne zamenjujte reagentov iz različnih serij, sicer bo padla občutljivost.
12.6 Komplete ELISA hranite pri 2-8 ℃, ne zamrzujte.Zaprite plošče z mikrovdolbinicami, med vsemi inkubacijami se izogibajte neposredni sončni svetlobi.Priporočljivo je, da mikrotitrske plošče pokrijete.
12.7 Raztopino substrata je treba opustiti, če se obarva.Reagenti so lahko slabi, če je vrednost absorbance (450/630 nm) ničelnega standarda manjša od 0,5 (A450 nm<0,5).
12.8 Reakcija obarvanja potrebuje 15 minut po dodatku raztopine A in raztopine B. Inkubacijske čase lahko podaljšate na 20 minut ali več, če je barva presvetla, da bi jo lahko določili.Nikoli ne prekoračite 30 minut, nasprotno, ustrezno skrajšajte čas inkubacije.
12.9 Optimalna reakcijska temperatura je 37 ℃.Višja ali nižja temperatura bo povzročila spremembe vrednosti občutljivosti in absorbance.
13. Shranjevanje
Pogoji shranjevanja: 2-8 ℃.
Rok skladiščenja: 12 mesecev.
