produktu

1. Pozadie

tylozínje makrolidové antibiotikum, ktoré sa používa hlavne ako antibakteriálne a antimykoplazmové.Boli stanovené prísne MRL, pretože tento liek môže v určitých skupinách viesť k závažným vedľajším účinkom.

Táto súprava je novým produktom založeným na technológii ELISA, ktorá je rýchla, jednoduchá, presná a citlivá v porovnaní s bežnou inštrumentálnou analýzou a potrebuje iba 1,5 hodiny na jednu operáciu, dokáže výrazne minimalizovať chyby obsluhy a intenzitu práce.

2. Princíp testu

Táto súprava je založená na nepriamej konkurenčnej technológii ELISA.Mikrotitračné jamky sú potiahnuté väzbovým antigénom.Tylozínový zvyšok vo vzorke súťaží s antigénom naneseným na mikrotitračnej platni o protilátku.Po pridaní enzýmom značenej protilátky sa na zobrazenie farby použije substrát TMB.Absorbancia vzorky negatívne súvisí s tylozínom, ktorý sa v nej nachádza, po porovnaní so štandardnou krivkou, vynásobenej faktorom riedenia, možno vypočítať množstvo rezíduí tylozínu vo vzorke.

3. Aplikácie

Táto súprava môže byť použitá pri kvantitatívnej a kvalitatívnej analýze rezíduí tylozínu v živočíšnom tkanive (kuracie, bravčové, kačacie) a mlieku, mede, vajciach atď.

4. Krížové reakcie

Tylozín ……………………………………………….. 100 %

Tilmikozín ……………………………………………… < 2 %

5. Požadované materiály

5.1 Vybavenie:

---- Mikrotitračný spektrofotometer (450nm/630nm)

---- Rotačný výparník alebo nástroje na sušenie dusíka

---- homogenizátor

----Shaker

----Odstredivka

---- Analytická váha (indukčnosť: 0,01 g)

---- Odmerná pipeta: 10 ml

---- Gumená pipetová žiarovka

----Odmerná banka: 10ml

---- Polystyrénové centrifugačné skúmavky: 50 ml

----Mikropipety: 20-200ml, 100-1000ml

250 ml multipipeta

5.2 Činidlá:

----Hydroxid sodný (NaOH, AR)

---- Hydrogénuhličitan sodný (NaHCO_3,AR)

---- Uhličitan sodný (NaCO₃, AR)

---- Kyselina trichlóroctová (AR)

---- Acetonitril (AR)

----Etylacetát (AR)

┅┅n-Hexán (AR)

----Deionizovaná voda

6. Komponenty súpravy

l Mikrotitračná platnička s 96 jamkami potiahnutými antigénom

l Štandardné roztoky (5 fliaš, 1 ml/fľaša)

0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb

l Štandardná kontrola napichovania: (1 ml/fľaša)1 ppm

l Enzýmový konjugát 1ml……………..…..červený uzáver

l Protilátkový roztok 7ml……………….……zelený uzáver

l Roztok A 7ml……………………….….……biely uzáver

l Roztok B 7ml…………………………………..červený uzáver

l Stop roztok 7 ml.……………….……….žltý uzáver

l 20×koncentrovaný premývací roztok 40ml

…………………………………..…priehľadný uzáver

l 4×koncentrovaný extrakčný roztok 50ml

……………………………………………….modrá čiapočka

7. Príprava činidiel:

Riešenie 1:0,1 mol/l roztoku NaOH

Navážte 0,4 g NaOH do 100 ml deionizovanej vody a úplne premiešajte.

Riešenie 2: 1 mol/l roztoku NaOH

Navážte 4 g NaOH do 100 ml deionizovanej vody a úplne premiešajte.

Riešenie 3: Uhličitanová tlmivá soľ

Riešenie1: 0,2M PB

Rozpustite 51,6 g sodíka₂HPO₄·12H₂O, 8,7 g NaH₂PO₄·2H₂O s deionizovanou vodou a zrieďte na 1000 ml.

Riešenie2: Extrakčný roztok

2× koncentrovaný extrakčný roztok zrieďte deionizovanou vodou v objemovom pomere 1:1(napr. 10ml 2×extrakčného roztoku + 10ml deionizovanej vody), ktorý sa použije na extrakciu vzorky,tento roztok možno skladovať pri 4 °C po dobu 1 mesiaca.

Riešenie3: Premývací roztok

20x koncentrovaný premývací roztok zrieďte deionizovanou vodou v objemovom pomere 1:19(napr. 5 ml 20x premývacieho roztoku + 95 ml deionizovanej vody), ktorý sa použije na umývanie tanierov.Tento roztok možno skladovať pri 4 °C po dobu 1 mesiaca.

8. Prípravy vzoriek

8.1 Upozornenie a bezpečnostné opatrenia pred prevádzkou:

(a) V procese experimentu použite jednorazové špičky a pri absorpcii iného činidla vymeňte špičky.

(b) Uistite sa, že všetky nástroje sú čisté.

c) Vzorku tkaniva uchovávajte v mrazničke.

(d) Pripravená vzorka by sa mala použiť na test naraz.

8.2 Živočíšne tkanivo (kuracie, bravčové atď.)

---- Homogenizujte vzorku homogenizátorom;

----Odoberte 2,0 ± 0,05 g homogenátu do 50 ml polystyrénovej centrifugačnej skúmavky;pridajte 2 ml 0,2 M PB (Riešenie1), pretrepte do rozpustenia a potom pridajte 8 ml etylacetátu a prudko pretrepávajte 3 minúty;

----Odstredivka na separáciu: 3000 g / teplota okolia / 5 min.

---- Preneste 4 ml supernatantu organickej fázy do 10 ml sklenenej skúmavky, vysušte vo vodnom kúpeli s teplotou 50-60 °C pod prúdom plynného dusíka;

---- Suchý zvyšok rozpustite v 1 ml n-hexánu, vortexujte 30 sekúnd, aby sa rozpustil, a potom pridajte 1 ml extrakčného roztoku (Riešenie2), vortexujte 1 min.odstredivka na separáciu: 3000g / teplota okolia / 5min

---- Odstráňte supernatant n-hexánovú fázu;odoberte 50 μl vodnej fázy substrátu na test.

Faktor riedenia: 1

8.2 Mlieko

----Odoberte 100 μl vzorky surového mlieka, zmiešajte s 900 μl extrakčného roztoku (Riešenie2) a úplne premiešajte.

----Odoberte 50 μl pripraveného roztoku na analýzu.

Faktor riedenia: 10

9. Proces testu

9.1 Upozornenie pred testom

9.1.1Uistite sa, že všetky reagencie a mikrojamky majú izbovú teplotu (20-25 °C).

9.1.2Vráťte všetky zvyšné činidlá do 2-8℃ihneď po použití.

9.1.3Správne premytie mikrojamiek je dôležitým krokom v procese testu;je to životne dôležitý faktor pre reprodukovateľnosť analýzy ELISA.

9.1.4 Apočas inkubácie vypnite svetlo a zakryte mikrojamky.

9.2 Kroky testu

9.2.1 Všetky reagencie vyberte pri izbovej teplote (20-25 °C) na viac ako 30 minút, pred použitím jemne pretrepte.

9.2.2 Vyberte potrebné mikrojamky a zvyšok ihneď vráťte do vrecka so zipsom pri teplote 2-8 °C.

9.2.3 Zriedený premývací roztok sa má pred použitím zohriať na izbovú teplotu.

9.2.4číslo:Očíslované polohy každej mikrojamky a všetky štandardy a vzorky by sa mali analyzovať v duplikáte.Zaznamenajte polohy štandardov a vzoriek.

9.2.5Add štandardný roztok/vzorka a roztok protilátky: Pridajte 50 µl štandardného roztoku ((poskytnutá súprava)) alebo pripravenú vzorku do príslušných jamiek.Pridajte 50 µl roztoku protilátky (poskytnutá súprava).Jemne premiešajte ručným potrasením platničky a inkubujte 30 minút pri 37 °C s krytom.

9.2.6Umyť: Jemne odstráňte kryt a vyčistite kvapalinu z jamiek a opláchnite mikrojamky 250 µl zriedeného premývacieho roztoku (Riešenie3) v intervale 10 s na 4-5 krát.Zvyšnú vodu absorbujte savým papierom (zvyšná vzduchová bublina sa dá odstrániť nepoužitou špičkou).

9.2.7Pridajte konjugát enzýmu: Pridajte 100 ml roztoku enzýmového konjugátu (poskytnutá súprava) do každej jamky, jemne premiešajte a inkubujte 30 minút pri 37 °C s krytom.Zopakujte krok umývania znova.

9.2.8Sfarbenie: Pridajte 50 µl roztoku A(poskytnutá súprava) a 50 µl roztoku B(poskytnutá súprava) do každej studne.Jemne premiešajte a inkubujte 15 minút pri 37 °C s krytom.

9.2.9Zmerajte: Pridajte 50 µl zastavovacieho roztoku (poskytnutá súprava) do každej studne.Jemne premiešajte a zmerajte absorbanciu pri 450 nm (odporúča sa meranie s duálnou vlnovou dĺžkou 450/630 nm. Výsledok odčítajte do 5 minút po pridaní zastavovacieho roztoku).

10. Výsledky

10,1 Percentuálna absorbancia

Priemerné hodnoty hodnôt absorbancie získané pre štandardy a vzorky sa vydelia hodnotou absorbancie prvého štandardu (nulový štandard ) a vynásobia sa 100 %.Nulový štandard sa teda rovná 100 % a hodnoty absorbancie sa uvádzajú v percentách.

B

Absorbancia (%) = —— × 100 %

B0

B ——absorbčný štandard (alebo vzorka)

B0 ——štandard nulovej absorpcie

10.2 Štandardná krivka

---- Nakreslenie štandardnej krivky: Zoberte hodnotu absorbancie štandardov ako os y, semilogaritmickú koncentráciu štandardného roztoku tylozínu (ppb) ako os x.

---- Koncentrácia tylozínu v každej vzorke (ppb), ktorú možno odčítať z kalibračnej krivky, sa vynásobí zodpovedajúcim faktorom riedenia každej sledovanej vzorky a získa sa skutočná koncentrácia vzorky.

Prosím, všimnite si:

na analýzu údajov bol vyvinutý špeciálny softvér, ktorý je možné poskytnúť na požiadanie.

11. Citlivosť, presnosť a presnosť

Citlivosť testu:1,5 ppb

Detekčný limit:

Živočíšne tkanivo ……………………………………………… 1,5 ppb Mlieko ……………………………………………………….. 15 ppb Presnosť:

Živočíšne tkanivo………………………………………… 80±15 %

Mlieko ……………………………………………….. 80 ± 10 %

presnosť:

Variačný koeficient súpravy ELISA je menší ako 10 %.

12. Upozornenie

12.1 Stredné hodnoty hodnôt absorbancie získané pre štandardy a vzorky sa znížia, ak reagencie a vzorky neboli regulované na izbovú teplotu (20-25 °C).

12.2 Nenechajte mikrojamky medzi jednotlivými krokmi vyschnúť, aby ste zabránili neúspešnej reprodukovateľnosti, a ďalší krok vykonajte ihneď po klepnutí na držiak mikrojamiek.

12.3 Pred použitím každé činidlo jemne pretrepte.

12.4 Udržujte pokožku mimo dosahu zastavovacieho roztoku, pretože je 0,5 MHz₂SO₄Riešenie.

12.5 Nepoužívajte súpravy zastarané.Nevymieňajte reagencie rôznych šarží, inak sa zníži citlivosť.

12.6 Súpravy ELISA uchovávajte pri 2-8 °C, nezmrazujte.Utesnite doštičky s mikrojamkami, počas všetkých inkubácií sa vyhýbajte priamemu slnečnému žiareniu.Odporúča sa zakryť mikrotitračné platne.

12.7 Roztok substrátu by sa mal opustiť, ak sa sfarbí.Ak je hodnota absorbancie (450/630 nm) nulového štandardu menšia ako 0,5 (A450 nm < 0,5), reagencie sa môžu pokaziť.

12.8 Farbiaca reakcia potrebuje 15 minút po pridaní roztoku A a roztoku B. Inkubačný čas môžete predĺžiť na 20 minút alebo viac, ak je farba príliš svetlá na to, aby sa dala určiť.Nikdy neprekračujte 30min, naopak, vhodne skráťte inkubačný čas.

12.9 Optimálna reakčná teplota je 37 °C.Vyššia alebo nižšia teplota povedie k zmenám hodnôt citlivosti a absorbancie.

13. Skladovanie

Skladovacie podmienky: 2-8 ℃.

Doba skladovania: 12 mesiacov.