Kit Immunoassay Enzim Kompetitif kanggo Analisis Kuantitatif Tylosin
Kit Immunoassay Enzim Kompetitif kanggo
Analisis kuantitatif sakaTylosin
1. Latar mburi
Tylosinminangka antibiotik macrolide, sing utamané ditrapake minangka antibakteri lan anti-mycoplasma.MRL sing ketat wis ditetepake amarga obat iki bisa nyebabake efek samping sing serius ing klompok tartamtu.
Kit iki minangka produk anyar adhedhasar teknologi ELISA, sing cepet, gampang, akurat lan sensitif dibandhingake karo analisis instrumental umum lan mung butuh 1,5 jam ing siji operasi, bisa nyuda kesalahan operasi lan intensitas kerja.
2. Prinsip Tes
Kit iki adhedhasar teknologi ELISA sing kompetitif ora langsung.Sumur mikrotiter dilapisi karo antigen kopling.Sisa tylosin ing sampel saingan karo antigen sing dilapisi ing piring mikrotiter kanggo antibodi.Sawise tambahan enzim sing dilabel anti-antibodi, substrat TMB digunakake kanggo nuduhake warna.Penyerapan sampel ana hubungane negatif karo tylosin sing ana ing kono, sawise mbandhingake karo Kurva Standar, dikalikan karo faktor pengenceran, jumlah residu tylosin ing sampel bisa diitung.
3. Aplikasi
Kit iki bisa digunakake ing analisis kuantitatif lan kualitatif residu tylosin ing jaringan kewan (pitik, daging babi, bebek) lan susu, madu, endhog, lsp.
4. Reaksi silang
Tylosin …………………………………………….. 100%
Tilmicosin…………………………………………<2%
5. Bahan sing dibutuhake
5.1 Peralatan:
----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)
---- Rotary evaporator utawa nitrogen pangatusan instruments
----homogenizer
---- Swara
---- Centrifuge
---- Neraca analitik (induktansi: 0,01g)
---- Pipet ukur : 10 ml
---- Bola pipet karet
---- Labu volumetrik: 10 ml
---- Tabung centrifuge polystyrene: 50ml
----Mikropipet: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipet
5.2 Reagen:
----Natrium hidroksida (NaOH, AR)
Natrium bikarbonat (NaHCO3,AR)
---- Natrium karbonat (NaCO3, AR)
---- Asam trichloroacetic (AR)
---- Asetonitril (AR)
----Etil asetat (AR)
┅┅n-Heksana (AR)
----Banyu deionisasi
6. Komponen Kit
l piring Microtiter kanthi 96 sumur sing dilapisi antigen
l Solusi standar (5 botol, 1ml / botol)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking kontrol standar: (1ml/botol)1 ppm
l Enzim konjugat 1ml ………………………………………………………………
l Larutan antibodi 7ml …………………………………………. tutup ijo
l Solusi A 7ml …………………………………………. tutup putih
l Solusi B 7ml................................................................... tutup abang
l Stop solution 7ml.……………………………………. tutup kuning
l 20× larutan cuci pekat 40ml
………………………………….. tutup transparan
l 4 × solusi ekstraksi pekat 50ml
……………………………………………….topi biru
7. Persiapan Reagen:
Solusi 1:0,1 mol/L larutan NaOH
Timbang 0,4g NaOH nganti 100ml banyu deionisasi lan nyampur kanthi lengkap.
Solusi 2: 1 mol/L larutan NaOH
Timbang 4g NaOH nganti 100ml banyu deionisasi lan nyampur nganti rampung.
Solusi 3: Garam penyangga karbonat
Solusi1: 0,2M PB
Larutake 51,6 g Na2HPO4· 12H2O, 8,7 g NaH2PO4· 2H2O karo banyu deionized lan dilute kanggo 1000ml.
Solusi2: Solusi ekstraksi
Diencerake 2 × solusi ekstraksi pekat karo banyu deionisasi ing rasio volume 1:1(contone 10ml larutan 2×ekstraksi + 10ml banyu deionisasi), sing bakal digunakake kanggo ekstraksi sampel,solusi iki bisa disimpen ing 4 ℃ kanggo 1 sasi.
Solusi3: wisuh solusi
Encer 20 × larutan cuci pekat karo banyu deionisasi kanthi rasio volume 1:19 (contone 5ml saka 20×wash solution + 95ml banyu deionisasi), sing bakal digunakake kanggo ngumbah piring.Solusi iki bisa disimpen ing suhu 4 ℃ suwene 1 wulan.
8. Preparasi Tuladha
8.1 Kabar lan pancegahan sadurunge operasi:
(a) Gunakake tips siji-mati ing proses eksperimen, lan ngganti tips nalika nyerep reagen beda.
(b) Priksa manawa kabeh piranti resik.
(c) Simpen sampel jaringan ing beku.
(d) Sampel sing wis disiapake kudu digunakake kanggo tes bebarengan.
8.2 Tisu kewan (pitik, daging babi, lsp)
----Homogenize sampel karo homogenizer;
---- Njupuk 2.0±0.05g saka homogenate menyang 50ml polystyrene tabung centrifuge;tambah 2ml saka 0,2M PB (solusi1) , goyangake kanggo dissolve, banjur tambahake 8ml etil asetat lan goyangake nganti 3 menit;
---- Centrifuge kanggo misahake: 3000g / suhu sekitar / 5min.
---- Transfer 4ml saka fase organik supernatant menyang tabung kaca 10ml, garing karo adus banyu 50-60 ℃ ing stream gas nitrogen;
----Bubarake turahan garing karo 1ml n-hexane, vortex kanggo 30s kanggo dissolve, lan banjur nambah 1ml saka solusi ekstraksi (solusi2), vortex kanggo 1 min.centrifuge kanggo misahake: 3000g / suhu sekitar / 5min
---- Mbusak fase n-heksana supernatan;njupuk 50μl saka substrat fase banyu kanggo assay.
Faktor pengenceran: 1
8.2 Susu
---- Ambil 100μl sampel susu mentah, campur dengan 900μl larutan ekstraksi (solusi2), lan nyampur kanthi lengkap.
---- Njupuk 50μl saka solusi disiapake kanggo assay.
Faktor pengenceran: 10
9. Proses Pengujian
9.1 Kabar sadurunge tes
9.1.1Priksa manawa kabeh reagen lan microwells kabeh ing suhu kamar (20-25 ℃).
9.1.2Bali kabeh reagen liyane kanggo 2-8℃sanalika sawise digunakake.
9.1.3Ngumbah microwell kanthi bener minangka langkah penting ing proses tes;iku faktor penting kanggo reproducibility saka analisis ELISA.
9.1.4 Ambusak cahya lan nutupi microwells nalika inkubasi.
9.2 Langkah-langkah Pengujian
9.2.1 Njupuk kabeh reagen metu ing suhu kamar (20-25 ℃) kanggo luwih saka 30min, goyangake alon-alon sadurunge digunakake.
9.2.2 Entuk microwells sing dibutuhake lan bali liyane menyang tas zip-kunci ing 2-8 ℃ langsung.
9.2.3 Solusi cuci sing diencerake kudu dipanasake maneh ing suhu kamar sadurunge digunakake.
9.2.4nomer:Nomer saben posisi microwell lan kabeh standar lan conto kudu mbukak ing duplikat.Rekam standar lan posisi sampel.
9.2.5Add solusi standar / sampel lan solusi antibodi: Tambah 50µl larutan standar((kit kasedhiya)) utawa sampel sing disiapake menyang sumur sing cocog.Tambahake 50µl larutan antibodi (kit kasedhiya).Nyampur alon-alon kanthi goyangake piring kanthi manual lan inkubasi nganti 30 menit ing 37 ℃ kanthi tutup.
9.2.6wisuh: Copot tutup alon-alon lan resiki cairan metu saka sumur lan mbilas microwell nganggo larutan cuci 250µl (solusi3) ing interval 10s kanggo 4-5 kaping.Nyerep banyu sing isih ana nganggo kertas penyerap (sisa gelembung udara bisa diilangi nganggo tip sing ora digunakake).
9.2.7Tambah enzim conjugate: Tambah 100 ml larutan konjugat enzim (kit kasedhiya) kanggo saben sumur, aduk alon-alon lan inkubasi nganti 30 menit ing 37 ℃ kanthi tutup.Baleni maneh langkah wisuh.
9.2.8pewarnaan: Tambah 50µl larutan A(kit kasedhiya) lan 50µl larutan B(kit kasedhiya) ing saben sumur.Nyampur alon-alon lan inkubasi nganti 15 menit ing 37 ℃ kanthi tutup.
9.2.9Ngukur: Tambah 50µl larutan stop(kit kasedhiya) ing saben sumur.Nyampur alon-alon lan ngukur absorbance ing 450nm (Sampeyan disaranake ukuran karo dual-panjang gelombang 450/630nm. Waca asil ing 5min sawise nambah solusi mandeg).
10. Asil
10.1 Penyerapan persentasi
Nilai rata-rata saka nilai absorbansi sing dipikolehi kanggo standar lan sampel dibagi karo nilai absorbansi standar pisanan (standar nol) lan dikali 100%.Standar nol digawe padha karo 100% lan nilai absorbansi dipetik ing persentase.
B
Penyerapan (%) = —— × 100%
B0
B ——standar panyerepan (utawa sampel)
B0 ——standar nol penyerapan
10.2 Kurva Standar
----Kanggo nggambar kurva standar: Njupuk nilai absorbansi standar minangka sumbu-y, semi logaritma saka konsentrasi larutan standar tylosin (ppb) minangka sumbu-x.
---- Konsentrasi tylosin saben sampel (ppb), sing bisa diwaca saka kurva kalibrasi, dikalikan karo faktor pengenceran sing cocog kanggo saben sampel sing diterusake, lan konsentrasi sampel sing nyata ditampa.
Mangga dicathet:
lunak khusus wis dikembangaké kanggo analisis data, kang bisa kasedhiya ing panyuwunan.
11. Sensitivitas, akurasi lan presisi
Sensitivitas tes:1,5 pb
watesan deteksi:
Jaringan kewan ……………………………………………………1.5ppb Susu ………………………………………………………..15ppb Akurasi:
Jaringan kewan………………………………………… 80±15%
Susu ……………………………………………………… 80±10%
Presisi:
Koefisien variasi kit ELISA kurang saka 10%.
12. Wara-wara
12.1 Nilai rata-rata saka nilai absorbansi sing dipikolehi kanggo standar lan conto bakal suda yen reagen lan conto durung diatur ing suhu kamar (20-25 ℃).
12.2 Aja ngidini microwells garing ing antarane langkah-langkah kanggo ngindhari reproduktifitas sing ora kasil lan operate langkah sabanjure sanalika sawise nutul wadhah microwells.
12.3 Goncang saben reagen alon-alon sadurunge digunakake.
12.4 Tansah kulit adoh saka solusi stop kanggo iku 0.5MH2SO4solusi.
12.5 Aja nggunakake kits out of date.Aja ngganti reagen saka macem-macem kelompok, utawa bakal nyuda sensitivitas.
12.6 Simpen kit ELISA ing 2-8 ℃, aja beku.Segel piring microwell liyane, Aja langsung suryo srengenge sak kabeh inkubasi.Nutupi piring microtiter dianjurake.
12.7 Solusi substrat kudu ditinggalake yen dadi warna.Reagen bisa dadi ala yen nilai absorbansi (450/630nm) saka standar nol kurang saka 0,5 (A450nm <0,5).
12.8 Reaksi pewarnaan mbutuhake 15min sawise nambahake solusi A lan solusi B. Lan sampeyan bisa ndawakake wektu inkubasi nganti 20min utawa luwih yen warnane entheng banget kanggo ditemtokake.Aja ngluwihi 30 menit, sebaliknya, nyepetake wektu inkubasi kanthi bener.
12.9 Suhu reaksi optimal yaiku 37 ℃.Suhu sing luwih dhuwur utawa luwih murah bakal nyebabake owah-owahan sensitivitas lan nilai absorbansi.
13. Panyimpenan
Kondisi panyimpenan: 2-8 ℃.
Periode panyimpenan: 12 sasi.
