mal

1. Paşnav

Tylosinantîbiyotîkek makrolîd e, ku bi giranî wekî antîbakterî û antî-mycoplasma tête bikar anîn.MRL-yên hişk nehatine damezrandin ji ber ku ev derman dibe ku di hin koman de bibe sedema bandorek alîgir a cidî.

Ev kît hilberek nû ye ku li ser bingeha teknolojiya ELISA-yê ye, ku li gorî analîzên amûrek hevpar zû, hêsan, rast û hesas e û di yek operasyonê de tenê 1,5 demjimêran hewce dike, ew dikare xeletiya xebitandinê û giraniya xebatê bi girîngî kêm bike.

2. Prensîba Testê

Ev kît li ser teknolojiya ELISA-ya nerasterast-hevrikî ye.Kulên mîkrotîter bi antîjena hevgirtinê têne pêçandin.Bermayiya tîlosîn a di nimûneyê de bi antîjena ku li ser plakaya mîkrotîterê ji bo antîpodê hatî pêçan re pêşbaziyê dike.Piştî lêzêdekirina enzîmê ku li dijî-antîpotê hatî nîşankirin, substrata TMB tê bikar anîn da ku reng nîşan bide.Veguheztina nimûneyê bi tîlozina ku tê de niştecîh ve girêdayî negatîf e, piştî berhevdana bi Kûreya Standard re, ku bi faktora dilopkirinê ve hatî zêdekirin, dikare mîqdara bermayiya tylosin di nimûneyê de were hesibandin.

3. Serlêdan

Ev kît dikare di analîza jimareyî û kalîteyî ya bermahiyên tylosin de di tevna heywanan de (mirîşk, goştê beraz, ordek) û şîr, hingiv, hêk, hwd de were bikar anîn.

4. Xaç-reaksiyonên

Tylosin……………………………………………..100%

Tilmicosin…………………………………………<2%

5. Materyalên Pêdivî ye

5.1 Amûrên:

----Spektrofotometera plakaya mîkrotîter (450nm/630nm)

---- Amûrên zuwakirina aveporator an nîtrojenê yên zivirî

----homojenîzator

----Şaker

----Sentrîfuj

----Balansa analîtîk (înduktîf: 0.01g)

----Pîpeta derçûyî: 10ml

----Ampûla pîpeta lastîkî

----Ferba volumetrî: 10ml

----Bûleyên santrîfujê yên polystyrene: 50ml

---- Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml

250 ml-pirpipet

5.2 Reagent:

----Sodyûm hîdroksîd (NaOH, AR)

---- Sodyum bîkarbonat (NaHCO_3,AR)

---- Karbonat Sodyûm (NaCO₃, AR)

----Trichloroacetic acid (AR)

---- Acetonitrile (AR)

----Etyl acetate (AR)

┅┅n-Hexane (AR)

----Ava deyonkirî

6. Kit Components

l Plateka mîkrotîterê ya bi 96 bîrên ku bi antîjenê ve girêdayî ye

l çareseriyên standard (5 şûşe, 1 ml/şûşe)

0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb

l Kontrola standard a spiking: (1ml / şûşeyek)1ppm

l Enzyme conjugate 1ml……………..…………kapa sor

l Çareseriya antîbody 7ml…………………………kapa kesk

l Çareseriya A 7ml……………………….………kapa spî

l Çareseriya B 7ml………………………………..kapa sor

l Çareseriyê rawestîne 7ml.………………………….kapa zer

l 20×çareseriya şuştinê ya konsantrekirî 40ml

……………………………………………kapek zelal

l 4 × çareseriya derxistina konsantrekirî 50ml

……………………………………………………………

7. Amadekirina Reagents:

Çareseriya 1:0,1mol/L çareseriya NaOH

0,4 g NaOH bi 100 ml ava deionîzekirî giran bikin û bi tevahî tevlihev bikin.

Çareserî 2: 1mol/L çareseriya NaOH

4 g NaOH bi 100 ml ava deyonîzekirî giran bikin û bi tevahî tevlihev bikin.

Çareserî 3: Xwê tampon karbonat

Çare1: 0.2M PB

51,6 gr Na bihelînin₂HPO₄· 12H₂O, 8,7 g NaH₂PO₄·2H₂O bi ava deyonîzekirî û bi 1000ml rijandin.

Çare2: Çareseriya derxistinê

2×çareseriya derxistina konsantrekirî bi ava deionîzekirî bi rêjeya qebareya 1:1(Mînak 10ml 2×çareseriya derxistinê + 10ml ava deyonkirî), ku dê ji bo derxistina nimûneyê were bikar anîn,ev çareserî dikare 1 meh li 4℃ were hilanîn.

Çare3: Çareseriya şuştinê

20×çareseriya şuştinê ya konsantrekirî bi ava deionîzekirî bi rêjeya 1:19 (Mînak 5ml 20×çareseriya şuştinê + 95 ml ava deyonkirî), ku dê ji bo şuştina plakan were bikar anîn.Ev çareserî dikare 1 mehê di 4℃ de were hilanîn.

8. Sample Preparations

8.1 Hişyar û tedbîrên berî operasyonê:

(a) Ji kerema xwe di pêvajoya ceribandinê de serişteyên yekcar bikar bînin, û gava ku reagentên cihêreng vedigirin serişteyan biguherînin.

(b) Bawer bikin ku hemî amûr paqij in.

(c) Nimûneya tevnvîsê di cemidî de bihêlin.

(d) Nimûneya amadekirî divê ji bo ceribandinê yekcar were bikar anîn.

8.2 Destmala heywanan (mirîşk, goştê beraz, hwd.)

----Nimûneyê bi homojenîzatorê homojen bikin;

---- 2,0±0,05g homojenatê bixin nav lûleya santrîfujê ya 50ml ya polîstirenê;2 ml ji 0.2M PB (çare1) , bihejînin ku bihelînin, û dûv re 8 ml etil acetate lê zêde bikin û 3 hûrdeman bi tundî bihejînin;

----Sentrifuge ji bo veqetandinê: 3000g / germahiya hawîrdorê / 5 min.

---- 4 ml ji qonaxa organîk a supernatant veguhezînin boriyek şûşê ya 10 ml, bi germahiya avê ya 50-60 ℃ di bin herikîna gaza nîtrojenê de hişk bikin;

---- Bermayê ziwa bi 1 ml n-hexane re bihelînin, 30 s dor bixin da ku bihelin, û dûv re 1 ml çareseriya derxistinê lê zêde bikin (çare2), ji bo 1 min vortex.santrîfuj ji bo veqetandinê: 3000g / germahiya hawîrdorê / 5 min

---- Qonaxa n-hexane ya supernatant rakin;ji bo ceribandinê 50 μl ji qonaxa avî ya substratê bistînin.

Faktora dilopkirinê: 1

8.2 Şîr

---- 100 μl nimûneya şîrê xav hildin, bi 900 μl çareseriya derxistinê re tevlihev bikin (çare2), û bi tevahî tevlihev bikin.

---- 50 μl ji çareseriya amadekirî ji bo ceribandinê bistînin.

Faktora dilopkirinê: 10

9. Pêvajoya assay

9.1 Berî ceribandinê hişyar bikin

9.1.1Bawer bikin ku hemî reagent û mîkrobat hemî li germahiya odeyê (20-25 ℃) ne.

9.1.2Hemî reagentên mayî vegerînin 2-8℃yekser piştî bikaranîn.

9.1.3Bi rast şuştina mîkrokan di pêvajoya vekolînê de gavek girîng e;ew faktora girîng a ji nû ve hilberandina analîza ELISA ye.

9.1.4 Adi dema înkubasyonê de ronahiyê vala derxînin û mîkrokaniyan veşêrin.

9.2 Gavên Assay

9.2.1 Hemî reagentan ji 30 hûrdeman zêdetir li germahiya odeyê (20-25℃) derxînin, berî ku bikar bînin bi nermî bihejînin.

9.2.2 Mîkrokên pêwîst derxînin û yên mayî tavilê di 2-8℃ de vegerînin çenteyê zip-lock.

9.2.3 Divê çareserîya şuştinê ya hûrkirî ji nû ve were germ kirin da ku li germahiya odeyê be berî ku were bikar anîn.

9.2.4Jimare:Pêdivî ye ku her pozîsyonên mîkrokalê û hemî standard û nimûneyên jimarekirî ducar bêne xebitandin.Pîvanên standard û nimûneyan tomar bikin.

9.2.5Add çareseriya standard/nimûne û çareseriya antîkor: 50 μl çareseriya standard ((kit pêşkêş kirin)) an nimûneya amadekirî ji bîrên têkildar re.50 μl çareseriya antîpodî lê zêde bikin (kit pêşkêş kirin).Bi hejandina plakaya bi destan bi nermî tevlihev bikin û 30 hûrdeman di 37℃ de bi serşokê vekin.

9.2.6Cil: Bi nermî qapaxê jêkin û şilê ji bîrê paqij bikin û mîkrokan bi 250 μl çareseriya şuştinê ya şuştinê bişon (çare3) di navberek 10 de ji bo 4-5 caran.Ava mayî bi kaxezek vegirtinê veşêrin (baba hewayê ya mayî bi tîpa ku nayê bikar anîn were rakirin).

9.2.7Enzyme conjugate zêde bikin: 100 ml çareseriya konjugata enzîmê (kit pêşkêş kirin) li her bîrekê, bi nermî tevlihev bikin û 30 hûrdeman li 37 ℃ bi serşokê vekin.Pêngava şuştinê dîsa dubare bikin.

9.2.8Rengdêr: 50 μl çareseriya A(kit pêşkêş kirin) û 50 μl çareseriya B(kit pêşkêş kirin) ji her bîrekê re.Bi nermî tevlihev bikin û 15 hûrdeman li 37 ℃ bi serşokê vekin.

9.2.9Pîvan: 50 μl ji çareseriya rawestandinê zêde bikin(kit pêşkêş kirin) ji her bîrekê re.Bi nermî tevlihev bikin û di 450nm de vegirtinê bipîvin (Pivana bi dirêjahiya pêla dualî ya 450/630nm tê pêşniyar kirin. Piştî ku çareseriya rawestanê lê zêde bikin, encamê di nav 5 hûrdeman de bixwînin).

10. Encam

10.1 Ji sedî absorbance

Nirxên navînî yên nirxên vegirtinê yên ku ji bo standardan û nimûneyan hatine wergirtin bi nirxa vegirtinê ya standarda yekem (sifir standard) ve têne dabeş kirin û bi 100% têne zêdekirin.Bi vî rengî standarda sifir bi 100% re wekhev tête çêkirin û nirxên vegirtinê bi sedî têne destnîşan kirin.

B

Absorbance (%) = —— × 100%

B0

B - standarda vegirtinê (an nimûne)

B0 ——standard sifir vegirtinê

10.2 Curve Standard

----Ji bo xêzkirina xêzeke standard: Nirxa vegirtinê ya standardan wekî y-xebat, nîv logarîtmîkî ya kombûna çareseriya standardên tylosin (ppb) wekî x-xebatê bigirin.

----Kêmbûna tylosin a her nimûneyê (ppb), ku dikare ji kerba kalibrasyonê were xwendin, bi faktora Dilhevkirinê ya têkildar a her nimûneyek ku tê şopandin, tê zêdekirin, û giraniya rastîn a nimûneyê tê bidestxistin.

Ji kerema xwe hişyar bikin:

nermalava taybetî ji bo analîzkirina daneyan hatî pêşve xistin, ku dikare li ser daxwazê ​​were peyda kirin.

11. Hestiyarî, rastbûn û rastbûn

Hestiyariya testê:1.5ppb

Sînorê tespîtkirinê:

Tîma heywanan…………………………………………1.5ppb Şîr…………………………………………………..15ppb Tamî:

Tevna heywanan………………………………………80±15%

Şîr……………………………………………………80±10%

Tamî:

Rêjeya guherîna kîta ELISA ji %10 kêmtir e.

12. Hişyar bikin

12.1 Ger reagent û nimûne li germahiya odeyê (20-25 ℃) nehatibin rêkûpêk kirin, nirxên navînî yên nirxên vegirtinê yên ku ji bo standard û nimûneyan hatine wergirtin dê kêm bibin.

12.2 Nehêlin ku mîkrokan di navbera gavan de zuwa bibin da ku ji nûveberbûna neserkeftî dûr bikevin û gavê din tavilê piştî ku tikandina xwedan mîkroyê zuwa bikin.

12.3 Berî ku bikar bînin her reagentê bi nermî bihejînin.

12.4 Çermê xwe ji çareseriya rawestandinê dûr bixin ji ber ku ew 0.5MH e₂SO₄çare.

12.5 Kitên kevnar bikar neynin.Reagentên beşên cûda neguherînin, an na ew ê hestiyariyê hilweşîne.

12.6 Kîtên ELISA di 2-8℃ de bihêlin, necemidin.Peleyên mîkrobêhnê yên mayî mor bikin, Di dema hemî inkubasyonê de rasterast ji tîrêja rojê dûr bixin.Tê pêşniyar kirin ku lewheyên mîkrotîter veşêrin.

12.7 Çareseriya substratê ger reng bizivire divê were terikandin.Dibe ku reagent xirab bibin heke nirxa vegirtinê (450/630nm) ya standarda sifir ji 0,5 (A450nm<0,5) kêmtir be.

12.8 Reaksiyona rengînkirinê 15 hûrdem piştî lêzêdekirina çareseriya A û çareseriya B hewce dike. Û hûn dikarin dema înkubasyonê heya 20 hûrdeman an jî zêdetir dirêj bikin heke reng pir sivik be ku nayê destnîşankirin.Tu carî 30 hûrdeman derbas nekin, berevajî vê, dema inkubasyonê bi rêkûpêk kurt bikin.

12.9 Germahiya reaksiyonê ya çêtirîn 37℃ ye.Germahiya bilind an nizm dê bibe sedema guheztina nirxên hestiyar û vegirtinê.

13. Storage

Rewşa hilanînê: 2-8℃.

Dema hilanînê: 12 meh.