Комплет за конкурентна ензимска имуноанализа за квантитативна анализа на тилозин
Комплет за конкурентна ензимска имуноанализа за
Квантитативна анализа наТилосин
1. Позадина
Тилосине макролиден антибиотик, кој главно се применува како антибактериски и антимикоплазма.Строги MRL се воспоставени бидејќи овој лек може да доведе до сериозни несакани ефекти кај одредени групи.
Овој комплет е нов производ базиран на технологијата ELISA, кој е брз, лесен, прецизен и чувствителен во споредба со вообичаената инструментална анализа и има потреба од само 1,5 часа во една операција, може значително да ги минимизира грешките при работа и интензитетот на работа.
2. Принцип на тест
Овој комплет се заснова на индиректно-конкурентна технологија ELISA.Микротитарните бунари се обложени со антиген за спојување.Остатокот од тилозин во примерокот се натпреварува со антигенот обложен на плочата за микротитар за антитело.По додавањето на ензимски означени анти-антитела, TMB супстратот се користи за да се покаже бојата.Апсорпцијата на мострата е негативно поврзана со содржината на тилозинот во неа, по споредбата со стандардната крива, помножена со факторот на разредување, може да се пресмета количината на остаток на тилозин во мострата.
3. Апликации
Овој комплет може да се користи во квантитативна и квалитативна анализа на остатоците од тилозин во животинското ткиво (пилешко, свинско, патка) и млеко, мед, јајца итн.
4. Вкрстени реакции
Тилозин………………………………………………..100%
Тилмикосин…………………………………………<2%
5. Потребни материјали
5.1 Опрема:
----Спектрофотометар на микротитерна плоча (450nm/630nm)
----Ротациски испарувач или инструменти за сушење со азот
----хомогенизатор
----Шикер
----Центрифуга
----Аналитичка рамнотежа (индуктивност: 0,01 g)
----Дипломирана пипета: 10мл
----Сијалица од гумена пипета
----Волуметриска колба: 10ml
----Центрифуги од полистирен: 50ml
----Микропипети: 20-200мл, 100-1000мл
250 ml-мултипипета
5.2 Реагенси:
----Натриум хидроксид (NaOH, AR)
---- Натриум бикарбонат (NaHCO3,AR)
---- Натриум карбонат (NaCO3, АР)
----Трихлороцетна киселина (AR)
---- Ацетонитрил (AR)
----Етил ацетат (AR)
┅┅n-хексан (AR)
----Дејонизирана вода
6. Компоненти на комплетот
l Микротитер плоча со 96 бунари обложени со антиген
l Стандардни раствори (5 шишиња, 1 ml/шише)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Стандардна контрола на шилење: (1ml/шише)1 ppm
l Ензимски конјугат 1ml…………………………црвена капа
l Раствор за антитела 7 ml…………………………зелена капа
l Раствор A 7ml…………………………………бела капа
l Раствор B 7ml………………………………..црвено капаче
l Стоп раствор 7ml………………………….жолта капа
l 20×концентриран раствор за миење 40ml
…………………………………………..проѕирна капа
l 4×концентриран раствор за екстракција 50ml
………………………………………………….сина капа
7. Подготовка на реагенси:
Решение 1:0,1 mol/L раствор на NaOH
Измерете 0,4 g NaOH до 100 ml дејонизирана вода и целосно измешајте.
Решение 2: 1mol/L раствор на NaOH
Измерете 4 g NaOH до 100 ml дејонизирана вода и целосно измешајте.
Решение 3: Карбонатна пуфер сол
Решение1: 0,2 M PB
Растворете 51,6 g Na2HPO4· 12 ч2О, 8,7 g NaH2PO4· 2 ч2О со дејонизирана вода и разредете до 1000 ml.
Решение2: Раствор за екстракција
Разредете го 2×концентрираниот раствор за екстракција со дејонизирана вода во волуменски сооднос од 1:1 (пр. 10ml 2×раствор за екстракција + 10ml дејонизирана вода), кој ќе се користи за екстракција на мострата,овој раствор може да се чува на 4℃ 1 месец.
Решение3: Раствор за миење
Разредете го 20×концентрираниот раствор за миење со дејонизирана вода во волуменски сооднос од 1:19 (пр. 5 ml 20×раствор за миење + 95 ml дејонизирана вода), кој ќе се користи за миење на чиниите.Овој раствор може да се чува на 4℃ 1 месец.
8. Примерочни подготовки
8.1 Известување и мерки на претпазливост пред операцијата:
(а) Ве молиме користете еднократни совети во процесот на експериментот и променете ги врвовите кога апсорбирате различни реагенси.
(б) Проверете дали сите инструменти се чисти.
(в) Чувајте го примерокот од ткиво во замрзнување.
(г) Подготвената мостра треба да се користи за анализа одеднаш.
8.2 Животинско ткиво (пилешко, свинско, итн.)
----Хомогенизирајте го примерокот со хомогенизатор;
----Однесете 2,0±0,05 g хомогенат во епрувета за центрифуга од полистирен од 50 ml;додадете 2 ml 0,2 M PB (решение1), протресете да се раствори, а потоа додадете 8 ml етил ацетат и жестоко протресете 3 мин;
----Центрифуга за одвојување: 3000g / амбиентална температура / 5мин.
----Префрлете 4 ml од органската фаза на супернатантот во стаклена цевка од 10 ml, исушете со водена бања 50-60 ℃ под проток на азотен гас;
---- Растворете го сувиот остаток со 1 ml n-хексан, вртлогирајте 30 секунди за да се раствори, а потоа додадете 1 ml раствор за екстракција (решение2), вител 1 мин.центрифуга за одвојување: 3000g / амбиентална температура / 5мин
----Отстранете ја супернатантот n-хексан фаза;земете 50 μl од водната фаза на подлогата за анализа.
Фактор на разредување: 1
8.2 Млеко
---- Земете 100 μl примерок од сурово млеко, измешајте со 900 μl раствор за екстракција (решение2), и целосно измешајте.
---- Земете 50 μl од подготвениот раствор за анализа.
Фактор на разредување: 10
9. Процес на анализа
9.1 Известување пред анализата
9.1.1Проверете дали сите реагенси и микробунари се на собна температура (20-25℃).
9.1.2Вратете ги сите останати реагенси на 2-8℃веднаш по употребата.
9.1.3Правилното миење на микробунарите е важен чекор во процесот на анализа;тоа е витален фактор за репродуктивноста на ELISA анализата.
9.1.4 Аисклучете ја светлината и покријте ги микробунарите за време на инкубацијата.
9.2 Чекори на анализа
9.2.1 Извадете ги сите реагенси на собна температура (20-25℃) повеќе од 30 минути, нежно протресете пред употреба.
9.2.2 Извадете ги потребните микробунари и вратете го остатокот во кесата со патент на температура од 2-8℃ веднаш.
9.2.3 Разредениот раствор за миење треба повторно да се загрее за да биде на собна температура пред употреба.
9.2.4Број:Нумерирани позиции на секој микробунар и сите стандарди и примероци треба да се користат во дупликат.Запишете ги стандардите и позициите на примероците.
9.2.5Aдд стандарден раствор/примерок и раствор на антитела: Додадете 50 μl стандарден раствор ((обезбеден комплет)) или подготвен примерок до соодветните бунари.Додадете 50 μl раствор на антитела (обезбеден комплет).Нежно измешајте со рачно протресување на плочата и инкубирајте 30 мин на 37℃ со капак.
9.2.6Измијте: Нежно извадете го капакот и исчистете ја течноста од бунарите и исплакнете ги микробунарите со 250µl разреден раствор за миење (решение3) во интервал од 10 секунди за 4-5 пати.Преостанатата вода впивајте ја со впивачка хартија (останатиот воздушен меур може да се отстрани со неискористен врв).
9.2.7Додадете ензимски конјугат: Додадете 100 ml ензимски конјугат раствор (обезбеден комплет) до секоја бунар, нежно измешајте и инкубирајте 30 мин на 37℃ со капак.Повторете го чекорот за миење повторно.
9.2.8Боење: Додадете 50 μl раствор А (обезбеден комплет) и 50 μl раствор Б (обезбеден комплет) на секој бунар.Нежно измешајте и инкубирајте 15 мин на 37℃ со капак.
9.2.9Мерка: Додадете 50 μl од стоп раствор (обезбеден комплет) на секој бунар.Нежно измешајте и измерете ја апсорпцијата на 450 nm (Се препорачува мерка со двојна бранова должина од 450/630 nm. Прочитајте го резултатот во рок од 5 минути по додавањето стоп раствор).
10. Резултати
10.1 Процентуална апсорпција
Средните вредности на вредностите на апсорпција добиени за стандардите и примероците се поделени со вредноста на апсорпција на првиот стандард (нулта стандард ) и се множат со 100%.Така, нултиот стандард е еднаков на 100%, а вредностите на апсорпција се цитирани во проценти.
B
Апсорпција (%) = —— × 100%
B0
Б —-стандард за апсорпција (или примерок)
B0 ——стандард за апсорпција нула
10.2 Стандардна крива
----За цртање стандардна крива: Земете ја вредноста на апсорпција на стандардите како y-оска, полулогаритамска на концентрацијата на стандардниот раствор на тилозин (ppb) како x-оска.
----Концентрацијата на тилозин на секој примерок (ppb), која може да се прочита од кривата на калибрација, се множи со соодветниот фактор на разредување на секој следен примерок и се добива вистинската концентрација на мострата.
Ве молиме забележете:
развиен е специјален софтвер за анализа на податоците, кој може да се обезбеди на барање.
11. Чувствителност, точност и прецизност
Тест чувствителност:1,5ppb
Ограничување за откривање:
Животинско ткиво…………………………………………1,5 ppb Млеко……………………………………………………..15ppb Точност:
Животинско ткиво……………………………………80±15%
Млеко…………………………………………………80±10%
Прецизност:
Коефициентот на варијација на комплетот ELISA е помал од 10%.
12. Забележете
12.1 Средните вредности на вредностите на апсорпција добиени за стандардите и примероците ќе се намалат доколку реагенсите и примероците не се регулирани на собна температура (20-25℃).
12.2.
12.3 Нежно протресете го секој реагенс пред употреба.
12.4 Држете ја вашата кожа подалеку од растворот за стопирање бидејќи е 0,5 MH2SO4решение.
12.5 Не користете ги застарените комплети.Не менувајте ги реагенсите од различни серии, во спротивно ќе ја намалите чувствителноста.
12.6 Чувајте ги ELISA комплетите на 2-8℃, не замрзнувајте.Запечатете ги микробунарските плочи за одмор, избегнувајте директна сончева светлина за време на сите инкубации.Се препорачува покривање на микротитарните плочи.
12.7 Растворот на подлогата треба да се напушти ако се обои.Реагенсите може да се влошат ако вредноста на апсорпција (450/630 nm) од нулта стандард е помала од 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 За реакцијата на боење потребни се 15 минути по додавањето на растворот А и растворот Б. И може да го продолжите опсегот на времето на инкубација до 20 минути или повеќе ако бојата е премногу светла за да се одреди.Никогаш не надминувајте 30 минути, напротив, правилно скратете го времето на инкубација.
12,9 Оптималната температура на реакцијата е 37℃.Повисоката или пониската температура ќе доведе до промена на чувствителноста и вредностите на апсорпција.
13. Складирање
Состојба на чување: 2-8℃.
Период на чување: 12 месеци.
