Комплект за конкурентен ензимен имуноанализ за количествен анализ на тилозин
Комплект за конкурентен ензимен имуноанализ за
Количествен анализ наТилозин
1. Предистория
Тилозине макролиден антибиотик, който се прилага главно като антибактериален и антимикоплазмен.Установени са строги МДГОВ, тъй като това лекарство може да доведе до сериозен страничен ефект при определени групи.
Този комплект е нов продукт, базиран на технологията ELISA, която е бърза, лесна, точна и чувствителна в сравнение с обикновения инструментален анализ и се нуждае само от 1,5 часа за една операция, може значително да минимизира грешките при операцията и интензивността на работа.
2. Принцип на теста
Този комплект е базиран на индиректно-конкурентна ELISA технология.Микротитърните ямки са покрити със свързващ антиген.Остатъкът от тилозин в пробата се конкурира с антигена, покрит върху микротитърната плака за антитялото.След добавянето на ензимно белязано анти-антитело се използва TMB субстрат за показване на цвета.Абсорбцията на пробата е отрицателно свързана с остатъка от тилозин в нея, след сравняване със стандартната крива, умножена по фактора на разреждане, може да се изчисли количеството остатък от тилозин в пробата.
3. Приложения
Този комплект може да се използва при количествен и качествен анализ на остатъците от тилозин в животински тъкани (пилешко, свинско, патешко) и мляко, мед, яйца и др.
4. Кръстосани реакции
Тилозин…………………………………………………..100%
Тилмикозин………………………………………………<2%
5. Необходими материали
5.1 Оборудване:
----Спектрофотометър за микротитърна плака (450nm/630nm)
---- Ротационен изпарител или инструменти за сушене на азот
----хомогенизатор
----Шейкър
---- Центрофуга
---- Аналитична везна (индуктивност: 0,01g)
----Градуирана пипета: 10 ml
----Гумена груша за пипета
----Меромерна колба: 10 ml
----Полистиренови центрофужни епруветки: 50 мл
----Микропипети: 20-200ml, 100-1000ml
250мл-мултипипета
5.2 Реактиви:
----Натриев хидроксид (NaOH, AR)
---- Натриев бикарбонат (NaHCO3,AR)
---- Натриев карбонат (NaCO3, AR)
---- Трихлороцетна киселина (AR)
---- Ацетонитрил (AR)
---- Етил ацетат (AR)
┅┅n-хексан (AR)
----Дейонизирана вода
6. Компоненти на комплекта
l Микротитърна плака с 96 ямки, покрити с антиген
l Стандартни разтвори (5 бутилки, 1 ml/бутилка)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Стандартна контрола за пиене: (1 ml/бутилка)1ppm
l Ензимен конюгат 1 ml……………..…..…червена капачка
l Разтвор на антитела 7 ml……………….……зелена капачка
l Разтвор A 7ml…………………….….……бяла капачка
l Разтвор B 7ml...……………………………..червена капачка
l Стоп разтвор 7ml.……………….……….жълта капачка
l 20 × концентриран разтвор за измиване 40 ml
…………………………………..…прозрачна капачка
l 4 × концентриран разтвор за екстракция 50 мл
……………………………………………….синя капачка
7. Подготовка на реагентите:
Решение 1:0,1 mol/L разтвор на NaOH
Претеглете 0,4 g NaOH към 100 ml дейонизирана вода и разбъркайте напълно.
Решение 2: 1 mol/L разтвор на NaOH
Претеглете 4 g NaOH към 100 ml дейонизирана вода и разбъркайте напълно.
Решение 3: Карбонатна буферна сол
Решение1: 0,2M PB
Разтворете 51,6 g Na2HPO4· 12 ч2О, 8,7 g NaH2PO4·2H2O с дейонизирана вода и се разрежда до 1000 ml.
Решение2: Разтвор за екстракция
Разредете 2 × концентрирания екстракционен разтвор с дейонизирана вода в обемно съотношение 1:1 (напр. 10 ml 2 × разтвор за екстракция + 10 ml дейонизирана вода), които ще се използват за извличане на проби,този разтвор може да се съхранява при 4 ℃ за 1 месец.
Решение3: Промивен разтвор
Разредете 20 пъти концентрирания промивен разтвор с дейонизирана вода в обемно съотношение 1:19(напр. 5 ml 20× разтвор за измиване + 95 ml дейонизирана вода), който ще се използва за измиване на чиниите.Този разтвор може да се съхранява при 4 ℃ в продължение на 1 месец.
8. Приготвяне на проби
8.1 Забележка и предпазни мерки преди работа:
(a) Моля, използвайте еднократни накрайници в процеса на експеримента и сменете накрайниците, когато абсорбирате различен реагент.
(b) Уверете се, че всички инструменти са чисти.
(c) Съхранявайте тъканната проба в замразено състояние.
(d) Приготвената проба трябва да се използва за анализ наведнъж.
8.2 Животински тъкани (пилешка, свинска и др.)
----Хомогенизирайте пробата с хомогенизатор;
----Вземете 2,0±0,05 g хомогенат в 50 ml полистиролова центрофужна епруветка;добавете 2 ml от 0,2M PB (решение1), разклатете, за да се разтвори и след това добавете 8 ml етил ацетат и разклатете яростно в продължение на 3 минути;
----Центрифуга за разделяне: 3000g / околна температура / 5мин.
---- Прехвърлете 4 ml от супернатантната органична фаза в стъклена епруветка от 10 ml, изсушете с водна баня при 50-60 ℃ под поток от азотен газ;
----Разтворете сухия остатък с 1 ml n-хексан, разбъркайте на вортекс за 30 секунди, за да се разтвори, и след това добавете 1 ml разтвор за екстракция (решение2), завихряйте за 1 минута.центрофуга за сепарация: 3000g / стайна температура / 5мин
----Отстранете супернатантната n-хексанова фаза;вземете 50 μl от водната фаза на субстрата за анализ.
Фактор на разреждане: 1
8.2 Мляко
----Вземете 100 μl проба от сурово мляко, смесете с 900 μl разтвор за екстракция (решение2) и разбъркайте напълно.
---- Вземете 50 μl от приготвения разтвор за анализ.
Фактор на разреждане: 10
9. Процес на анализ
9.1 Забележка преди анализа
9.1.1Уверете се, че всички реагенти и микроямки са на стайна температура (20-25 ℃).
9.1.2Върнете всички останали реактиви на 2-8℃веднага след употреба.
9.1.3Правилното измиване на микроямките е важна стъпка в процеса на анализ;това е жизненоважен фактор за възпроизводимостта на ELISA анализа.
9.1.4 Аизвадете светлината и покрийте микроямките по време на инкубацията.
9.2 Стъпки на анализа
9.2.1 Извадете всички реагенти на стайна температура (20-25 ℃) за повече от 30 минути, разклатете внимателно преди употреба.
9.2.2 Извадете необходимите микроямки и незабавно върнете останалите в торбичката с цип при 2-8 ℃.
9.2.3 Разреденият промивен разтвор трябва да се затопли отново до стайна температура преди употреба.
9.2.4Номер:Номерираните позиции на всяка микроямка и всички стандарти и проби трябва да бъдат пуснати в два екземпляра.Запишете позициите на стандартите и пробите.
9.2.5Add стандартен разтвор/проба и разтвор на антитяло: Добавете 50µl стандартен разтвор((осигурен комплект)) или подготвена проба към съответните ямки.Добавете 50 µl разтвор на антитела (осигурен комплект).Разбъркайте внимателно чрез разклащане на плаката ръчно и инкубирайте за 30 минути при 37 ℃ с капак.
9.2.6Мия: Внимателно отстранете капака и изчистете течността от ямките и изплакнете микроямките с 250 µl разреден промивен разтвор (решение3) на интервал от 10s за 4-5 пъти.Попийте остатъчната вода с абсорбираща хартия (останалото въздушно мехурче може да се отстрани с неизползван накрайник).
9.2.7Добавете ензимен конюгат: Добавете 100 ml разтвор на ензимен конюгат (осигурен комплект) към всяка ямка, разбъркайте внимателно и инкубирайте за 30 минути при 37 ℃ с капак.Повторете стъпката на измиване отново.
9.2.8Оцветяване: Добавете 50µl разтвор A(осигурен комплект) и 50 µl разтвор B(осигурен комплект) към всяка ямка.Разбъркайте внимателно и инкубирайте за 15 минути при 37 ℃ с капак.
9.2.9Измерете: Добавете 50 µl от стоп разтвора (осигурен комплект) към всяка ямка.Разбъркайте внимателно и измерете абсорбцията при 450 nm (препоръчва се измерване с двойна дължина на вълната от 450/630 nm. Прочетете резултата в рамките на 5 минути след добавяне на стоп разтвор).
10. Резултати
10.1 Процентна абсорбция
Средните стойности на стойностите на абсорбция, получени за стандартите и пробите, се разделят на стойността на абсорбцията на първия стандарт (нулев стандарт) и се умножават по 100%.По този начин нулевият стандарт се прави равен на 100% и стойностите на абсорбция се цитират в проценти.
B
Абсорбция (%) = —— ×100%
B0
B ——стандарт за абсорбция (или проба)
B0 ——стандарт за нулева абсорбция
10.2 Стандартна крива
----За да начертаете стандартна крива: Вземете стойността на абсорбцията на стандартите като y-ос, полулогаритмична на концентрацията на стандартния разтвор на тилозин (ppb) като х-ос.
----Концентрацията на тилозин на всяка проба (ppb), която може да бъде разчетена от кривата на калибриране, се умножава по съответния фактор на разреждане на всяка следвана проба и се получава действителната концентрация на пробата.
Моля отбележете:
разработен е специален софтуер за анализ на данни, който може да бъде предоставен при поискване.
11. Чувствителност, точност и прецизност
Тест за чувствителност:1,5 ppb
Граница на откриване:
Животинска тъкан………………………….……………1,5ppb Мляко…………………………………………….....…..15ppb Точност:
Животинска тъкан…………………………………………80±15%
Мляко……………………………………..……….……80±10%
Точност:
Коефициентът на вариация на комплекта ELISA е по-малък от 10%.
12. Забележка
12.1 Средните стойности на стойностите на абсорбцията, получени за стандартите и пробите, ще бъдат намалени, ако реактивите и пробите не са регулирани до стайна температура (20-25 ℃).
12.2 Не позволявайте микроямките да изсъхнат между стъпките, за да избегнете неуспешна възпроизводимост, и започнете следващата стъпка веднага след като докоснете държача на микроямките.
12.3 Разклатете внимателно всеки реагент преди употреба.
12.4 Пазете кожата си от стоп разтвора, тъй като той е 0,5MH2SO4решение.
12.5 Не използвайте остарелите комплекти.Не разменяйте реагентите от различни партиди, в противен случай това ще намали чувствителността.
12.6 Съхранявайте комплектите ELISA при 2-8 ℃, не замразявайте.Запечатайте микроямковите плаки, избягвайте пряка слънчева светлина по време на всички инкубации.Препоръчва се покриване на микротитърните плаки.
12.7 Субстратният разтвор трябва да се изостави, ако оцвети.Реагентите може да са повредени, ако стойността на абсорбция (450/630 nm) на нулевия стандарт е по-малка от 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Реакцията на оцветяване се нуждае от 15 минути след добавянето на разтвор А и разтвор Б. И можете да удължите интервалите от време на инкубация до 20 минути или повече, ако цветът е твърде светъл, за да бъде определен.Никога не превишавайте 30 минути, напротив, съкратете правилно времето за инкубация.
12.9 Оптималната реакционна температура е 37 ℃.По-висока или по-ниска температура ще доведе до промени в стойностите на чувствителността и абсорбцията.
13. Съхранение
Условия на съхранение: 2-8 ℃.
Срок на съхранение: 12 месеца.
