تولید - محصول

1. پس زمینه

تایلوسینیک آنتی بیوتیک ماکرولید است که عمدتا به عنوان آنتی باکتریال و ضد مایکوپلاسما استفاده می شود.MRLهای سختگیرانه ای ایجاد شده است زیرا این دارو ممکن است منجر به عوارض جانبی جدی در گروه های خاص شود.

این کیت محصولی جدید مبتنی بر فناوری ELISA است که در مقایسه با آنالیزهای معمولی ابزاری سریع، آسان، دقیق و حساس است و تنها به 1.5 ساعت در یک عملیات نیاز دارد، می تواند تا حد قابل توجهی خطای عملیات و شدت کار را به حداقل برساند.

2. اصل تست

این کیت مبتنی بر فناوری ELISA غیرمستقیم رقابتی است.چاه های میکروتیتر با آنتی ژن جفت کننده پوشانده شده اند.باقی مانده تایلوزین در نمونه با آنتی ژن پوشانده شده روی صفحه میکروتیتر برای آنتی بادی رقابت می کند.پس از افزودن آنتی بادی با برچسب آنزیمی، از بستر TMB برای نشان دادن رنگ استفاده می شود.میزان جذب نمونه با محل تایلوزین موجود در آن رابطه منفی دارد، پس از مقایسه با منحنی استاندارد، ضرب در ضریب رقت، مقدار باقیمانده تایلوزین در نمونه قابل محاسبه است.

3. برنامه های کاربردی

این کیت می تواند در تجزیه و تحلیل کمی و کیفی باقیمانده تایلوزین در بافت حیوانی (مرغ، گوشت خوک، اردک) و شیر، عسل، تخم مرغ و غیره استفاده شود.

4. واکنش های متقاطع

تایلوزین………………………………………………..100%

تیلمیکوزین………………………………………<2%

5. مواد مورد نیاز

5.1 تجهیزات:

---- اسپکتروفتومتر صفحه میکروتیتر (450nm/630nm)

---- اواپراتور روتاری یا ابزار خشک کن نیتروژن

---- همگن کننده

---- تکان دهنده

----سانتریفیوژ

---- تعادل تحلیلی (القایی: 0.01 گرم)

---- پیپت مدرج: 10 میلی لیتر

----لامپ پیپت لاستیکی

---- فلاسک حجمی: 10 میلی لیتر

----لوله های سانتریفیوژ پلی استایرن: 50 میلی لیتر

---- میکروپیپت ها: 20-200 میلی لیتر، 100-1000 میلی لیتر

250 میلی لیتر-مولتی پیپت

5.2 معرفها:

----هیدروکسید سدیم (NaOH، AR)

---- بی کربنات سدیم (NaHCO_3,AR)

---- کربنات سدیم (NaCO₃، AR)

---- تری کلرواستیک اسید (AR)

---- استونیتریل (AR)

----اتیل استات (AR)

┅┅n-هگزان (AR)

----آب دی یونیزه

6. اجزای کیت

l صفحه میکروتیتر با 96 چاهک پوشیده شده با آنتی ژن

l محلول استاندارد (5 بطری، 1 میلی لیتر / بطری)

0ppb، 0.5ppb، 1.5ppb، 4.5ppb، 13.5ppb

l کنترل استاندارد اسپکینگ: (1 میلی لیتر در بطری)1ppm

l کنژوگه آنزیم 1 میلی لیتر…………………………….. کلاهک قرمز

محلول آنتی بادی 7 میلی لیتر………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

l محلول A 7 میلی لیتر…………………………………………………………………………………………………………………………

l محلول B 7ml…………………………………..کلاهک قرمز

l محلول استاپ 7 میلی لیتر…………………………….کلاه زرد

l 20×محلول شستشو غلیظ 40ml

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

l 4× محلول استخراج غلیظ 50 میلی لیتر

…………………………………………….کلاه آبی

7. آماده سازی معرف ها:

راه حل 1:محلول NaOH 0.1mol/L

0.4 گرم NaOH را با 100 میلی لیتر آب دیونیزه وزن کرده و کاملاً مخلوط کنید.

راه حل 2: محلول 1mol/L NaOH

4 گرم NaOH را با 100 میلی لیتر آب دیونیزه وزن کرده و کاملاً مخلوط کنید.

راه حل 3: نمک بافر کربناته

راه حل1: 0.2M PB

51.6 گرم Na را حل کنید₂HPO₄· 12 ساعت₂O، 8.7 گرم NaH₂PO₄· 2 ساعت₂با آب دیونیزه شده O و تا 1000 میلی لیتر رقیق کنید.

راه حل2: محلول استخراج

محلول استخراج غلیظ 2× را با آب دیونیزه به نسبت حجمی 1:1 رقیق کنید.به عنوان مثال 10 میلی لیتر محلول 2× استخراج + 10 میلی لیتر آب دیونیزه) که برای استخراج نمونه استفاده می شود،این محلول را می توان به مدت 1 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

راه حل3: محلول شستشو

محلول شستشوی غلیظ 20× را با آب دیونیزه به نسبت حجمی 1:19 رقیق کنید.به عنوان مثال 5 میلی لیتر محلول شستشو 20× + 95 میلی لیتر آب دیونیزه) که برای شستشوی بشقاب ها استفاده خواهد شد.این محلول را می توان به مدت 1 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

8. آماده سازی نمونه

8.1 هشدار و اقدامات احتیاطی قبل از عملیات:

(الف) لطفاً از نکات یکباره در فرآیند آزمایش استفاده کنید و هنگام جذب معرف های مختلف، نکات را تغییر دهید.

(ب) مطمئن شوید که همه ابزار تمیز هستند.

(ج) نمونه بافت را در یخ نگه دارید.

(د) نمونه آماده شده باید یکباره برای سنجش استفاده شود.

8.2 بافت حیوانی (مرغ، گوشت خوک و غیره)

---- نمونه را با هموژنایزر همگن کنید.

----2.0±0.05 گرم هموژن را در یک لوله سانتریفیوژ پلی استایرن 50 میلی لیتری قرار دهید.2 میلی لیتر 0.2M PB اضافه کنید (راه حل1) تکان دهید تا حل شود و سپس 8 میلی لیتر اتیل استات اضافه کنید و به مدت 3 دقیقه به شدت تکان دهید.

----سانتریفیوژ برای جداسازی: 3000 گرم / دمای محیط / 5 دقیقه.

---- 4 میلی لیتر از فاز آلی رویی را به یک لوله شیشه ای 10 میلی لیتری منتقل کنید، با حمام آب 50-60 درجه سانتیگراد زیر جریان گاز نیتروژن خشک کنید.

---- باقیمانده خشک را با 1 میلی لیتر هگزان n- حل کنید، به مدت 30 ثانیه گرداب کنید تا حل شود و سپس 1 میلی لیتر محلول استخراج اضافه کنید.راه حل2) به مدت 1 دقیقه گرداب کنید.سانتریفیوژ برای جداسازی: 3000 گرم / دمای محیط / 5 دقیقه

---- فاز n-هگزان مایع رویی را بردارید.50 میکرولیتر از فاز آبی زیرلایه را برای سنجش مصرف کنید.

ضریب رقیق سازی: 1

8.2 شیر

---- 100 میکرولیتر از نمونه شیر خام را بگیرید، با 900 میکرولیتر محلول استخراج مخلوط کنید.راه حل2) و کاملا مخلوط کنید.

---- 50 میکرولیتر از محلول آماده شده را برای سنجش مصرف کنید.

ضریب رقیق سازی: 10

9. فرآیند سنجش

9.1 قبل از سنجش توجه کنید

9.1.1اطمینان حاصل کنید که همه معرف ها و ریز چاه ها در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) هستند.

9.1.2بقیه معرف ها را به 2-8 برگردانید℃بلافاصله پس از استفاده

9.1.3شستن صحیح ریز چاه ها مرحله مهمی در فرآیند سنجش است.این عامل حیاتی برای تکرارپذیری آنالیز ELISA است.

9.1.4 Aدر طول انکوباسیون نور را خالی کنید و ریز چاه ها را بپوشانید.

9.2 مراحل سنجش

9.2.1 همه معرف ها را در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) به مدت بیش از 30 دقیقه خارج کنید، قبل از استفاده به آرامی تکان دهید.

9.2.2 ریز چاه های مورد نیاز را خارج کنید و بقیه را فوراً در کیسه زیپ لاک در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد برگردانید.

9.2.3 محلول شستشوی رقیق شده باید قبل از استفاده دوباره گرم شود تا در دمای اتاق باشد.

9.2.4عدد:هر موقعیت ریز چاه شماره گذاری شده و همه استانداردها و نمونه ها باید به صورت تکراری اجرا شوند.استانداردها و موقعیت های نمونه را ثبت کنید.

9.2.5Add محلول/نمونه استاندارد و محلول آنتی بادی: 50 میکرولیتر محلول استاندارد ((کیت ارائه شده)) یا نمونه آماده شده به چاه های مربوطه.50 میکرولیتر محلول آنتی بادی اضافه کنیدکیت ارائه شده).با تکان دادن دستی بشقاب را به آرامی مخلوط کرده و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با درب انکوبه کنید.

9.2.6شستشو: پوشش را به آرامی بردارید و مایع را از چاه ها خارج کنید و ریز چاه ها را با محلول شستشوی رقیق شده 250 میکرولیتر بشویید.راه حل3) در فاصله 10 ثانیه برای 4-5 بار.آب باقیمانده را با کاغذ جاذب جذب کنید (با نوک استفاده نشده می توان بقیه حباب هوا را از بین برد).

9.2.7کونژوگه آنزیمی را اضافه کنید: 100 میلی لیتر محلول مزدوج آنزیم اضافه کنیدکیت ارائه شدهدر هر چاه، به آرامی مخلوط کنید و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با پوشش انکوبه کنید.مرحله شستشو را دوباره تکرار کنید.

9.2.8رنگ آمیزی50 میکرولیتر محلول A اضافه کنیدکیت ارائه شده) و 50 میکرولیتر محلول B (کیت ارائه شده) به هر چاه.به آرامی مخلوط کنید و به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با درب انکوبه کنید.

9.2.9اندازه گرفتن: 50 میکرولیتر محلول توقف اضافه کنیدکیت ارائه شده) به هر چاه.به آرامی مخلوط کنید و جذب را در 450 نانومتر اندازه گیری کنید (پیشنهاد می شود با طول موج دوگانه 450/630 نانومتر اندازه گیری کنید. نتیجه را در عرض 5 دقیقه پس از افزودن محلول توقف بخوانید).

10. نتایج

10.1 درصد جذب

مقادیر متوسط ​​مقادیر جذب به‌دست‌آمده برای استانداردها و نمونه‌ها بر مقدار جذب استاندارد اول (استاندارد صفر) تقسیم شده و در 100% ضرب می‌شود.بنابراین استاندارد صفر برابر با 100% ساخته شده و مقادیر جذب به صورت درصد ذکر شده است.

B

جذب (%) = —— × 100%

B0

ب - استاندارد جذب (یا نمونه)

B0 ——استاندارد جذب صفر

10.2 منحنی استاندارد

----برای رسم منحنی استاندارد: مقدار جذب استانداردها را به عنوان محور y، نیمه لگاریتمی غلظت محلول استاندارد تایلوزین (ppb) به عنوان محور x در نظر بگیرید.

---- غلظت تایلوزین هر نمونه (ppb) که از روی منحنی کالیبراسیون قابل خواندن است، در ضریب رقت متناظر هر نمونه به دنبال آن ضرب می شود و غلظت واقعی نمونه بدست می آید.

لطفا توجه کنید:

نرم افزار ویژه ای برای تجزیه و تحلیل داده ها ایجاد شده است که در صورت درخواست قابل ارائه می باشد.

11. حساسیت، دقت و دقت

حساسیت تست:1.5ppb

حد تشخیص:

بافت حیوانی………………………………………1.5ppb شیر…………………………………………………..۱۵ppb دقت:

بافت حیوانی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

شیر………………………………………………………80±10%

دقت، درستی:

ضریب تغییرات کیت الایزا کمتر از 10 درصد است.

12. توجه کنید

12.1 اگر معرف ها و نمونه ها در دمای اتاق (20 تا 25 درجه سانتیگراد) تنظیم نشده باشند، میانگین مقادیر جذب به دست آمده برای استانداردها و نمونه ها کاهش می یابد.

12.2 برای جلوگیری از تکرار ناموفق، اجازه ندهید ریز چاه ها بین مراحل خشک شوند و مرحله بعدی را بلافاصله پس از ضربه زدن به نگهدارنده ریز چاه ها اجرا کنید.

12.3 هر معرف را قبل از استفاده به آرامی تکان دهید.

12.4 پوست خود را از محلول استاپ دور نگه دارید زیرا 0.5MH است₂SO₄راه حل.

12.5 از کیت های قدیمی استفاده نکنید.معرف های دسته های مختلف را تعویض نکنید وگرنه حساسیت را کاهش می دهد.

12.6 کیت های ELISA را در دمای 2-8 درجه سانتیگراد نگه دارید، یخ نزنید.مهر و موم کردن صفحات میکرو چاه استراحت، از نور مستقیم خورشید در طول تمام جوجه کشی اجتناب کنید.پوشاندن صفحات میکروتیتر توصیه می شود.

12.7 محلول بستر در صورت تغییر رنگ باید کنار گذاشته شود.اگر مقدار جذب (450/630 نانومتر) استاندارد صفر کمتر از 0.5 (A450nm<0.5) باشد، ممکن است معرف ها خراب شوند.

12.8 واکنش رنگ آمیزی به 15 دقیقه پس از افزودن محلول A و محلول B نیاز دارد. و اگر رنگ برای تعیین رنگ خیلی روشن است، می توانید محدوده زمان انکوباسیون را تا 20 دقیقه یا بیشتر افزایش دهید.هرگز از 30 دقیقه تجاوز نکنید، برعکس، زمان انکوباسیون را به درستی کوتاه کنید.

12.9 دمای بهینه واکنش 37 درجه سانتیگراد است.دمای بالاتر یا پایین تر منجر به تغییر مقادیر حساسیت و جذب می شود.

13. ذخیره سازی

شرایط نگهداری: 2-8 ℃.

مدت زمان نگهداری: 12 ماه.