ชุดทดสอบ Enzyme Immunoassay สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ Tylosin
ชุดเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ที่แข่งขันได้สำหรับ
การวิเคราะห์เชิงปริมาณของไทโลซิน
1. พื้นหลัง
ไทโลซินเป็นยาปฏิชีวนะ macrolide ซึ่งส่วนใหญ่จะใช้เป็นยาต้านแบคทีเรียและต่อต้าน mycoplasmaมีการกำหนด MRLs ที่เข้มงวดเนื่องจากยานี้อาจนำไปสู่ผลข้างเคียงที่ร้ายแรงในบางกลุ่ม
ชุดนี้เป็นผลิตภัณฑ์ใหม่ที่ใช้เทคโนโลยี ELISA ซึ่งรวดเร็ว ง่าย แม่นยำ และละเอียดอ่อนเมื่อเทียบกับการวิเคราะห์ด้วยเครื่องมือทั่วไป และใช้เวลาเพียง 1.5 ชั่วโมงในการทำงานหนึ่งครั้ง จึงสามารถลดข้อผิดพลาดในการทำงานและความเข้มของงานได้อย่างมาก
2. หลักการทดสอบ
ชุดนี้ใช้เทคโนโลยี ELISA ที่มีการแข่งขันทางอ้อมหลุมไมโครไทเทอร์เคลือบด้วยแอนติเจนคู่ควบสารตกค้างไทโลซินในตัวอย่างแข่งขันกับแอนติเจนที่เคลือบบนแผ่นไมโครไทเทอร์สำหรับแอนติบอดีหลังจากการเติมเอนไซม์ที่มีข้อความว่าแอนติบอดี สารตั้งต้น TMB จะถูกใช้เพื่อแสดงสีการดูดซับของตัวอย่างมีความสัมพันธ์เชิงลบกับไทโลซินที่อาศัยอยู่ในนั้น หลังจากเปรียบเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐาน คูณด้วยปัจจัยการเจือจาง จะสามารถคำนวณปริมาณไทโลซินตกค้างในตัวอย่างได้
3. แอปพลิเคชัน
ชุดนี้สามารถใช้ในการวิเคราะห์เชิงปริมาณและคุณภาพของสารตกค้างไทโลซินในเนื้อเยื่อสัตว์ (ไก่ หมู เป็ด) และนม น้ำผึ้ง ไข่ ฯลฯ
4. ปฏิกิริยาข้าม
ไทโลซิน………………………………………………..100%
ทิลมิโคซิน………………………………………………<2%
5. วัสดุที่จำเป็น
5.1 อุปกรณ์:
----เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบแผ่นไมโครไทเทอร์ (450nm/630nm)
---- เครื่องระเหยแบบหมุนหรือเครื่องอบแห้งด้วยไนโตรเจน
---- โฮโมจิไนเซอร์
----เชคเกอร์
----เครื่องหมุนเหวี่ยง
----เครื่องชั่งเชิงวิเคราะห์ (ค่าความเหนี่ยวนำ: 0.01g)
----ปิเปตแบบแท่ง: 10ml
----หลอดปิเปตยาง
----กระติกน้ำปริมาตร : 10ml
----หลอดโพลีสไตรีนเซนติฟิวจ์: 50ml
----ไมโครปิเปต: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipett
5.2 รีเอเจนต์:
----โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH, AR)
----โซเดียมไบคาร์บอเนต (NaHCO3,เออาร์)
---- โซเดียมคาร์บอเนต (NaCO3, เออาร์)
----กรดไตรคลอโรอะซิติก (AR)
---- อะซีโตไนไทรล์ (AR)
----เอทิลอะซิเตท (AR)
┅┅n-เฮกเซน (AR)
---- น้ำปราศจากไอออน
6. ส่วนประกอบของชุดอุปกรณ์
l แผ่น Microtiter ที่มี 96 หลุมเคลือบด้วยแอนติเจน
l สารละลายมาตรฐาน (5 ขวด 1ml/ขวด)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l การควบคุมมาตรฐาน Spiking: (1ml/ขวด)1ppm
l เอนไซม์คอนจูเกต 1ml……………..…..… ฝาสีแดง
l สารละลายแอนติบอดี 7ml……………….……ฝาสีเขียว
l น้ำยา A 7ml…………………….….……ฝาขาว
l Solution B 7ml……………………………..ฝาสีแดง
l น้ำยาหยุด 7ml.……………….……….ฝาเหลือง
l 20×น้ำยาล้างจานเข้มข้น 40ml
…………………………………..…ฝาใส
l 4×น้ำยาสกัดเข้มข้น 50ml
……………………………………………….ฝาสีน้ำเงิน
7. การเตรียมรีเอเจนต์:
แนวทางที่ 1:สารละลาย NaOH 0.1 โมล/ลิตร
ชั่งน้ำหนัก NaOH 0.4 กรัม ต่อน้ำปราศจากไอออน 100 มล. แล้วผสมให้เข้ากัน
โซลูชันที่ 2: สารละลาย NaOH 1 โมล/ลิตร
ชั่ง NaOH 4 กรัมกับน้ำปราศจากไอออน 100 มล. แล้วผสมให้เข้ากัน
แนวทางแก้ไข 3: เกลือบัฟเฟอร์คาร์บอเนต
สารละลาย1: 0.2M PB
ละลาย Na 51.6g2ฮป4·12ชม2O, 8.7 กรัมของ NaH2PO4·2H2O กับน้ำปราศจากไอออนและเจือจางถึง 1,000 มล.
สารละลาย2: สารละลายสกัด
เจือจางสารละลายสกัดเข้มข้น 2× กับน้ำปราศจากไอออนในอัตราส่วนปริมาตร 1:1(เช่น สารละลายสกัด 2×10 มล. + น้ำปราศจากไอออน 10 มล) ซึ่งจะใช้ในการสกัดตัวอย่างสารละลายนี้สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃ เป็นเวลา 1 เดือน.
สารละลาย3: น้ำยาล้าง
เจือจางน้ำยาซักล้างเข้มข้น 20× กับน้ำปราศจากไอออนในอัตราส่วนปริมาตร 1:19(เช่น น้ำยาล้าง 20×5 มล. + น้ำปราศจากไอออน 95 มล) ซึ่งจะใช้สำหรับล้างจานสารละลายนี้สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃ เป็นเวลา 1 เดือน.
8. การเตรียมตัวอย่าง
8.1 ประกาศและข้อควรระวังก่อนดำเนินการ:
(ก) โปรดใช้ทิปแบบใช้ครั้งเดียวในกระบวนการทดลอง และเปลี่ยนทิปเมื่อดูดซับรีเอเจนต์ที่แตกต่างกัน
(b) ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเครื่องมือทั้งหมดสะอาด
(c) เก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อไว้ในช่องแช่แข็ง
(d) ควรใช้ตัวอย่างที่เตรียมไว้สำหรับการทดสอบทันที
8.2 เนื้อเยื่อสัตว์ (ไก่ หมู ฯลฯ)
---- ทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวกันด้วยโฮโมจีไนเซอร์
---- นำโฮโมจีเนต 2.0 ± 0.05 กรัม มาใส่ในหลอดหมุนเหวี่ยงโพลีสไตรีนขนาด 50 มล.เพิ่ม 2ml ของ 0.2M PB (สารละลาย1) เขย่าให้ละลาย จากนั้นเติมเอทิลอะซิเตต 8 มล. แล้วเขย่าแรงๆ เป็นเวลา 3 นาที
----เครื่องปั่นแยกสำหรับการแยก: 3000g / อุณหภูมิแวดล้อม / 5 นาที
---- ถ่ายโอนเฟสอินทรีย์ส่วนเกิน 4 มล. ลงในหลอดแก้วขนาด 10 มล. แห้งด้วยอ่างน้ำ 50-60 ℃ ภายใต้กระแสก๊าซไนโตรเจน
----ละลายของแห้งที่เหลือด้วย n-hexane 1 มล. วอร์เท็กซ์เป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อให้ละลาย จากนั้นเติมสารละลายสกัด 1 มล. (สารละลาย2) น้ำวนเป็นเวลา 1 นาทีเครื่องปั่นแยกสำหรับการแยก: 3000g / อุณหภูมิแวดล้อม / 5 นาที
----ลบเฟส n-hexane ส่วนเกิน;ใช้ 50μl ของเฟสที่เป็นน้ำของซับสเตรตสำหรับการทดสอบ
ปัจจัยการเจือจาง: 1
8.2 นม
----นำตัวอย่างน้ำนมดิบ 100μl ผสมกับสารละลายสกัด 900μl (สารละลาย2) และผสมให้เข้ากัน
---- ใช้ 50μl ของสารละลายที่เตรียมไว้สำหรับการทดสอบ
ปัจจัยการเจือจาง: 10
9. กระบวนการทดสอบ
9.1 แจ้งให้ทราบก่อนการทดสอบ
9.1.1ตรวจสอบให้แน่ใจว่ารีเอเจนต์และไมโครเวลล์ทั้งหมดอยู่ที่อุณหภูมิห้อง (20-25℃)
9.1.2คืนรีเอเจนต์ที่เหลือทั้งหมดไปที่ 2-8℃ทันทีที่ใช้
9.1.3การล้างไมโครเวลล์อย่างถูกต้องเป็นขั้นตอนสำคัญในกระบวนการวิเคราะห์เป็นปัจจัยสำคัญต่อความสามารถในการทำซ้ำของการวิเคราะห์ ELISA
9.1.4 กทำให้แสงเป็นโมฆะและปิดหลุมไมโครเวลล์ระหว่างการบ่ม
9.2 ขั้นตอนการทดสอบ
9.2.1 นำน้ำยาทั้งหมดออกมาที่อุณหภูมิห้อง (20-25 ℃) นานกว่า 30 นาที เขย่าเบา ๆ ก่อนใช้งาน
9.2.2 นำไมโครเวลล์ที่ต้องการออกและนำส่วนที่เหลือใส่ถุงซิปล็อคทันทีที่อุณหภูมิ 2-8 ℃
9.2.3 ควรอุ่นน้ำยาซักล้างที่เจือจางแล้วให้อยู่ในอุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน
9.2.4ตัวเลข:ระบุหมายเลขตำแหน่งไมโครเวลล์ทุกตำแหน่ง และมาตรฐานและตัวอย่างทั้งหมดควรทำซ้ำกันบันทึกมาตรฐานและตำแหน่งตัวอย่าง
9.2.5Add สารละลายมาตรฐาน/ตัวอย่างและสารละลายแอนติบอดี: เติมสารละลายมาตรฐาน 50µl((มีชุดให้)) หรือตัวอย่างที่เตรียมไว้ไปยังหลุมที่เกี่ยวข้องเติมสารละลายแอนติบอดี 50µl(มีชุดให้).ผสมเบา ๆ โดยการเขย่าจานด้วยมือและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 ℃พร้อมฝาปิด
9.2.6ล้าง: ค่อยๆ ถอดฝาครอบออกและทำให้ของเหลวบริสุทธิ์ออกจากหลุม และล้างไมโครเวลด้วยน้ำยาล้างเจือจาง 250µl (สารละลาย3) ในช่วงเวลา 10 วินาทีเป็นเวลา 4-5 ครั้งดูดซับน้ำที่เหลือด้วยกระดาษซับ (สามารถกำจัดฟองอากาศที่เหลือได้ด้วยปลายที่ไม่ได้ใช้)
9.2.7เพิ่มเอนไซม์คอนจูเกต: เติมสารละลายเอนไซม์คอนจูเกต 100 มล.(มีชุดให้) ให้เข้ากัน ผสมอย่างเบามือและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C พร้อมฝาปิดทำซ้ำขั้นตอนการล้างอีกครั้ง.
9.2.8สี: เติมสารละลาย A 50µl(มีชุดให้) และ 50µl ของสารละลาย B(มีชุดให้) ไปแต่ละหลุมผสมเบา ๆ และบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37 ℃พร้อมฝาปิด
9.2.9วัด: เติมสารละลายหยุด 50µl(มีชุดให้) ไปแต่ละหลุมผสมอย่างเบามือและวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร (แนะนำให้วัดด้วยความยาวคลื่นคู่ที่ 450/630 นาโนเมตร อ่านผลลัพธ์ภายใน 5 นาทีหลังจากเติมสารละลายหยุด)
10. ผลลัพธ์
10.1 เปอร์เซ็นต์การดูดกลืนแสง
ค่าเฉลี่ยของค่าการดูดกลืนแสงที่ได้จากมาตรฐานและตัวอย่างจะหารด้วยค่าการดูดกลืนแสงของมาตรฐานแรก (มาตรฐานศูนย์ ) และคูณด้วย 100%ดังนั้น ค่ามาตรฐานศูนย์จึงเท่ากับ 100% และค่าการดูดกลืนแสงจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์
B
ค่าการดูดซับ (%) = —— ×100%
B0
B —— มาตรฐานการดูดซับ (หรือตัวอย่าง)
B0 —— ค่าการดูดซับเป็นศูนย์มาตรฐาน
10.2 เส้นโค้งมาตรฐาน
----ในการวาดเส้นโค้งมาตรฐาน: นำค่าการดูดกลืนแสงของมาตรฐานเป็นแกน y ซึ่งเป็นค่ากึ่งลอการิทึมของความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานไทโลซิน (ppb) เป็นแกน x
----ความเข้มข้นของไทโลซินของแต่ละตัวอย่าง (ppb) ซึ่งสามารถอ่านได้จากเส้นโค้งการสอบเทียบ จะถูกคูณด้วยปัจจัยการเจือจางที่สอดคล้องกันของแต่ละตัวอย่างตามมา และจะได้ความเข้มข้นที่แท้จริงของตัวอย่าง
โปรดสังเกต:
ซอฟต์แวร์พิเศษได้รับการพัฒนาสำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล ซึ่งสามารถจัดเตรียมให้ตามคำขอ
11. ความไว ความแม่นยำ และความแม่นยำ
ทดสอบความไว:1.5ppb
ขีดจำกัดการตรวจจับ:
เนื้อเยื่อสัตว์………………………….…………….1.5ppb นม……………………………………………….....…..15ppb ความแม่นยำ:
เนื้อเยื่อสัตว์…………………………...…………80±15%
นม…………………………………..……….……80±10%
ความแม่นยำ:
ค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันของชุด ELISA น้อยกว่า 10%
12. ประกาศ
12.1 ค่าเฉลี่ยของค่าการดูดกลืนแสงที่ได้สำหรับมาตรฐานและตัวอย่างจะลดลงถ้ารีเอเจนต์และตัวอย่างไม่ได้รับการควบคุมที่อุณหภูมิห้อง (20-25 ℃)
12.2 ห้ามปล่อยให้หลุมขนาดเล็กแห้งระหว่างขั้นตอนต่างๆ เพื่อหลีกเลี่ยงความสามารถในการทำซ้ำที่ไม่สำเร็จ และดำเนินการขั้นตอนต่อไปทันทีหลังจากแตะที่ยึดหลุมขนาดเล็ก
12.3 เขย่าน้ำยาแต่ละตัวเบา ๆ ก่อนใช้
12.4 อย่าให้ผิวหนังของคุณอยู่ห่างจากสารละลายหยุดเนื่องจากมีค่า 0.5MH2SO4สารละลาย.
12.5 อย่าใช้ชุดอุปกรณ์ที่ล้าสมัยอย่าแลกเปลี่ยนรีเอเจนต์ของชุดต่างๆ มิฉะนั้นจะทำให้ความไวลดลง
12.6 เก็บชุด ELISA ไว้ที่ 2-8 ℃ ห้ามแช่แข็งปิดผนึกแผ่นไมโครเวลล์ที่เหลือ หลีกเลี่ยงการถูกแสงแดดโดยตรงระหว่างการบ่มทั้งหมดแนะนำให้ปิดแผ่นไมโครไทเทอร์
12.7 ควรทิ้งสารละลายพื้นผิวหากเปลี่ยนสีรีเอเจนต์อาจเสียได้หากค่าการดูดกลืนแสง (450/630nm) ของมาตรฐานศูนย์น้อยกว่า 0.5 (A450nm<0.5)
12.8 ปฏิกิริยาการเกิดสีต้องใช้เวลา 15 นาทีหลังจากเติมสารละลาย A และสารละลาย B และคุณสามารถยืดระยะเวลาการบ่มให้นานขึ้นเป็น 20 นาทีหรือมากกว่านั้นหากสีอ่อนเกินไปที่จะกำหนดได้ไม่ควรเกิน 30 นาที ในทางกลับกัน ลดระยะเวลาการบ่มให้เหมาะสม
12.9 อุณหภูมิในการทำปฏิกิริยาที่เหมาะสมคือ 37℃อุณหภูมิที่สูงขึ้นหรือต่ำลงจะทำให้ค่าความไวแสงและค่าการดูดกลืนแสงเปลี่ยนไป
13. ที่เก็บของ
สภาพการเก็บรักษา: 2-8 ℃
ระยะเวลาการเก็บรักษา: 12 เดือน.
