Kit de inmunoensaio enzimático competitivo para a análise cuantitativa da tilosina
Kit de inmunoensaio enzimático competitivo para
Análise cuantitativa deTilosina
1. Antecedentes
Tilosinaé un antibiótico macrólido, que se aplica principalmente como antibacteriano e antimicoplasma.Establecéronse LMR estritos xa que este medicamento pode provocar efectos secundarios graves en certos grupos.
Este kit é un novo produto baseado na tecnoloxía ELISA, que é rápido, sinxelo, preciso e sensible en comparación coa análise instrumental común e só precisa de 1,5 horas nunha operación, pode minimizar considerablemente o erro de operación e a intensidade do traballo.
2. Principio de proba
Este kit está baseado na tecnoloxía ELISA de competición indirecta.Os pozos de microtitulación están recubertos de antíxeno de acoplamento.O residuo de tilosina na mostra compite co antíxeno revestido na placa de microtitulación polo anticorpo.Despois da adición de anticorpos marcados con encimas, utilízase o substrato de TMB para mostrar a cor.A absorción da mostra está negativamente relacionada coa tilosina que reside nela, despois de comparar coa curva estándar, multiplicada polo factor de dilución, pódese calcular a cantidade de residuos de tilosina na mostra.
3. Aplicacións
Este kit pódese utilizar na análise cuantitativa e cualitativa de residuos de tilosina en tecidos animais (polo, porco, pato) e leite, mel, ovo, etc.
4. Reaccións cruzadas
Tilosina……………………………………………………..100%
Tilmicosina……………………………………………………<2%
5. Materiais necesarios
5.1 Equipos:
---- Espectrofotómetro de placa de microtitulación (450 nm/630 nm)
----Evaporador rotativo ou instrumentos de secado de nitróxeno
----homogeneizador
---- Axitador
----Centrífuga
----Balanza analítica (inductancia: 0,01 g)
----Pipeta graduada: 10 ml
---- Bombilla de pipeta de goma
----Matraz aforado: 10ml
----Tubos de centrífuga de poliestireno: 50 ml
----Micropipetas: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multippette
5.2 Reactivos:
----Hidróxido de sodio (NaOH, AR)
---- Bicarbonato de sodio (NaHCO3,AR)
---- Carbonato de sodio (NaCO3, AR)
----Ácido tricloroacético (AR)
---- Acetonitrilo (AR)
----Acetato de etilo (AR)
┅┅n-hexano (AR)
----Auga desionizada
6. Compoñentes do kit
l Placa de microtitulación con 96 pozos recubertos de antíxeno
l Solucións estándar (5 botellas, 1 ml/botella)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Control estándar de espiga: (1 ml/botella)1 ppm
l Conxugado enzimático 1 ml……………..…..…cap vermello
l Solución de anticuerpos 7 ml………………………….……tapón verde
l Solución A 7 ml………………………….….……tapón branco
l Solución B 7ml………………………………………..tapón vermello
l Solución de parada 7 ml.……………….……….tapón amarelo
l 20×solución de lavado concentrada 40ml
…………………………………..…tapón transparente
l 4×solución de extracción concentrada 50ml
…………………………………………….gorra azul
7. Preparación dos reactivos:
Solución 1:Solución de NaOH 0,1 mol/L
Pesar 0,4 g de NaOH a 100 ml de auga desionizada e mesturar completamente.
Solución 2Solución de NaOH 1 mol/L
Pesar 4 g de NaOH a 100 ml de auga desionizada e mesturar completamente.
Solución 3: Sal tampón carbonato
Solución1: 0,2 M PB
Disolver 51,6 g de Na2HPO4· 12 h2O, 8,7 g de NaH2PO4· 2 horas2O con auga desionizada e dilúese a 1000 ml.
Solución2: Solución de extracción
Diluír a solución de extracción concentrada 2x con auga desionizada nunha proporción de volume de 1:1 (por exemplo, 10 ml de solución de extracción 2 × + 10 ml de auga desionizada), que se utilizará para a extracción de mostras,esta solución pódese almacenar a 4 ℃ durante 1 mes.
Solución3: solución de lavado
Diluír a solución de lavado concentrada 20 × con auga desionizada nunha proporción de volume de 1:19 (por exemplo, 5 ml de solución de lavado 20 × + 95 ml de auga desionizada), que se utilizará para lavar os pratos.Esta solución pódese almacenar a 4 ℃ durante 1 mes.
8. Preparacións da mostra
8.1 Aviso e precaucións antes da operación:
(a) Use puntas únicas no proceso do experimento e cambie as puntas cando absorba reactivos diferentes.
(b) Asegúrese de que todos os instrumentos estean limpos.
(c) Manter a mostra de tecido conxelada.
(d) A mostra preparada debe utilizarse para o ensaio dunha soa vez.
8.2 Tecido animal (polo, porco, etc.)
----Homoxeneizar a mostra con homoxeneizador;
----Tome 2,0±0,05 g de homoxeneado nun tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml;engadir 2 ml de 0,2 M PB (solución1), axita para disolver e despois engade 8 ml de acetato de etilo e axita con forza durante 3 minutos;
----Centrífuga para separación: 3000g/temperatura ambiente/5min.
---- Transfire 4 ml da fase orgánica sobrenadante nun tubo de vidro de 10 ml, seque cun baño de auga a 50-60 ℃ baixo corrente de nitróxeno;
---- Disolve o resto seco con 1 ml de n-hexano, axita durante 30 segundos para disolver e despois engade 1 ml de solución de extracción (solución2), agitar durante 1 min.Centrífuga para separación: 3000 g / temperatura ambiente / 5 min
----Eliminar a fase n-hexano sobrenadante;tomar 50 μl da fase acuosa do substrato para o ensaio.
Factor de dilución: 1
8.2 Leite
---- Tome 100 μl de mostra de leite cru, mestura con 900 μl de solución de extracción (solución2) e mestura completamente.
----Tomar 50 μl da solución preparada para o ensaio.
Factor de dilución: 10
9. Proceso de ensaio
9.1 Aviso antes do ensaio
9.1.1Asegúrese de que todos os reactivos e micropozos estean a temperatura ambiente (20-25 ℃).
9.1.2Volve todos os reactivos restantes a 2-8℃inmediatamente despois de usar.
9.1.3Lavar correctamente os micropozos é un paso importante no proceso de ensaio;é o factor vital para a reproducibilidade da análise ELISA.
9.1.4 Aanular a luz e cubrir os micropozos durante a incubación.
9.2 Pasos do ensaio
9.2.1 Saque todos os reactivos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante máis de 30 minutos, axite suavemente antes do uso.
9.2.2 Saca os micropozos necesarios e devolve o resto á bolsa con peche con cremallera a 2-8 ℃ inmediatamente.
9.2.3 A solución de lavado diluída débese quentar de novo a temperatura ambiente antes de usala.
9.2.4Número:Cada posición dos micropozos numeradas e todos os patróns e mostras deben executarse por duplicado.Rexistrar os estándares e as posicións das mostras.
9.2.5Add solución estándar/mostra e solución de anticorpos: Engade 50 µl de solución estándar ((kit proporcionado)) ou mostra preparada aos pozos correspondentes.Engade 50 µl de solución de anticorpos (kit proporcionado).Mestura suavemente axitando a placa manualmente e incuba durante 30 min a 37 ℃ con tapa.
9.2.6Lavar: Retire a tapa suavemente e purifique o líquido dos pozos e enxágüe os micropozos con 250 µl de solución de lavado diluída (solución3) a intervalos de 10 segundos durante 4-5 veces.Absorbe a auga residual con papel absorbente (a burbulla de aire restante pódese eliminar coa punta non utilizada).
9.2.7Engadir conxugado enzimático: Engade 100 ml de solución de conxugado enzimático (kit proporcionado) a cada pozo, mestura suavemente e incuba durante 30 min a 37 ℃ con tapa.Repita o paso de lavado de novo.
9.2.8Coloración: Engade 50 µl de solución A(kit proporcionado) e 50 µl de solución B(kit proporcionado) a cada pozo.Mestura suavemente e incuba durante 15 minutos a 37 ℃ con tapa.
9.2.9Medida: Engade 50 µl da solución de parada (kit proporcionado) a cada pozo.Mestura suavemente e mide a absorbancia a 450 nm (suxírese medir coa lonxitude de onda dual de 450/630 nm. Le o resultado dentro de 5 minutos despois de engadir a solución de parada).
10. Resultados
10.1 Absorbancia porcentual
Os valores medios dos valores de absorbancia obtidos para os patróns e as mostras divídense polo valor de absorbancia do primeiro patrón (patrón cero) e multiplícanse polo 100%.Así, o patrón cero faise igual ao 100% e os valores de absorbancia cítanse en porcentaxes.
B
Absorbancia (%) = —— × 100%
B0
B —— estándar de absorbancia (ou mostra)
B0 ——absorción cero estándar
10.2 Curva estándar
----Para trazar unha curva estándar: Tome o valor de absorbancia dos patróns como eixe y, semilogarítmico da concentración da solución patrón de tilosina (ppb) como eixe x.
----A concentración de tilosina de cada mostra (ppb), que se pode ler a partir da curva de calibración, multiplícase polo correspondente Factor de dilución de cada mostra seguida e obtense a concentración real da mostra.
Observe:
desenvolveuse un software especial para a análise de datos, que se pode proporcionar baixo petición.
11. Sensibilidade, exactitude e precisión
Sensibilidade da proba:1,5 ppb
Límite de detección:
Tecido animal………………………………………… 1,5 ppb Leite…………………………………………………………..15 ppb Precisión:
Tecido animal………………………………… 80±15%
Leite………………………………………..……….……80±10%
Precisión:
O coeficiente de variación do kit ELISA é inferior ao 10%.
12. Aviso
12.1 Os valores medios dos valores de absorbancia obtidos para os patróns e as mostras reduciranse se os reactivos e as mostras non se regulan a temperatura ambiente (20-25 ℃).
12.2 Non permita que os micropozos se sequen entre os pasos para evitar unha reproducibilidade non exitosa e realice o seguinte paso inmediatamente despois de tocar o soporte de micropozos.
12.3 Agite cada reactivo suavemente antes do uso.
12.4 Manteña a súa pel lonxe da solución de parada porque é 0,5MH2SO4solución.
12.5 Non use os kits obsoletos.Non cambie os reactivos de lotes diferentes ou, se non, baixará a sensibilidade.
12.6 Manteña os kits ELISA a 2-8 ℃, non conxelar.Selle as placas de micropozos de descanso, evite a luz solar directa durante todas as incubacións.Recoméndase cubrir as placas de microtitulación.
12.7 Débese abandonar a solución do substrato se cambia de cor.Os reactivos poden deteriorarse se o valor de absorbancia (450/630 nm) do estándar cero é inferior a 0,5 (A450nm <0,5).
12.8 A reacción de coloración necesita 15 minutos despois da adición da solución A e da solución B. E pode prolongar o intervalo de tempo de incubación ata 20 minutos ou máis se a cor é demasiado clara para ser determinada.Nunca supere os 30min, pola contra, acurte o tempo de incubación adecuadamente.
12.9 A temperatura de reacción óptima é 37 ℃.A temperatura máis alta ou máis baixa provocará cambios nos valores de sensibilidade e absorbancia.
13. Almacenamento
Condicións de almacenamento: 2-8 ℃.
Prazo de almacenamento: 12 meses.
