Tilosinaren analisi kuantitatiborako entzima-saioen kit lehiakorra
Entzimetako immunoensayo lehiakorreko kita
Azterketa kuantitatiboaTilosina
1. Aurrekariak
Tilosinaantibiotiko makrolido bat da, batez ere bakterioen eta mikoplasmaren aurkako gisa aplikatzen dena.MRL zorrotzak ezarri dira, droga honek albo-ondorio larriak eragin ditzakeelako talde jakin batzuetan.
Kit hau ELISA teknologian oinarritutako produktu berria da, azkarra, erraza, zehatza eta sentikorra den ohiko analisi instrumentalarekin alderatuta eta operazio bakarrean 1,5 ordu baino ez ditu behar, eragiketa-errorea eta lan-intentsitatea nabarmen gutxitu ditzake.
2. Proba-printzipioa
Kit hau zeharkako lehiako ELISA teknologian oinarritzen da.Mikrotitulazio-hobiak akoplamendu-antigenoz estalita daude.Laginaren tilosina-hondarrak antigorputzaren mikrotitulazio-plakan estalitako antigenoarekin lehiatzen dira.Antigorputzak markatutako entzimak gehitu ondoren, TMB substratua erabiltzen da kolorea erakusteko.Laginaren xurgapena negatiboki erlazionatuta dago bertan bizi den tilosinarekin, Kurba Estandarrarekin alderatu ondoren, diluzio-faktorearekin biderkatuta, laginaren tilosinaren hondakinen kantitatea kalkula daiteke.
3. Aplikazioak
Kit hau animalia-ehunetan (oilaskoa, txerria, ahatea) eta esnean, eztia, arrautza eta abarretan tilosin-hondakinen analisi kuantitatibo eta kualitatiboetan erabil daiteke.
4. Zeharkako erreakzioak
Tilosina………………………………………………………..%100
Tilmikosina……………………………………………………<%2
5. Beharrezko materiala
5.1 Ekipamenduak:
----Mikrotitulazio plaka espektrofotometroa (450nm/630nm)
----Lurrungailu birakaria edo nitrogenoa lehortzeko tresnak
----homogeneizatzailea
----Shaker
---- Zentrifugatzailea
----Balantza analitikoa (induktantzia: 0,01 g)
----Pipeta graduatua: 10ml
----Gomazko pipeta-bonbilla
----Matraze bolumetrikoa: 10ml
----Polestirenozko zentrifuga-hodiak: 50ml
----Mikropipetak: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Erreaktiboak:
----Sodio hidroxidoa (NaOH, AR)
----Sodio bikarbonatoa (NaHCO3,AR)
---- Sodio karbonatoa (NaCO3, AR)
---- Azido trikloroacetikoa (AR)
---- Azetonitrilo (AR)
----Etil azetatoa (AR)
┅┅n-hexanoa (AR)
----Ura desionizatua
6. Kitaren osagaiak
l Antigenoz estalitako 96 putzudun mikrotitulazio-plaka
l Soluzio estandarrak (5 botila, 1 ml / botila)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking kontrola estandarra: (1 ml/botila)1 ppm
l Entzima konjokatua 1ml……………..…..…txapel gorria
l Antigorputz-disoluzioa 7ml………………………………txapel berdea
l A disoluzioa 7 ml………………………….….……txapel zuria
l B disoluzioa 7ml………………………………..txapel gorria
l Stop disoluzioa 7ml.……………….……….txapel horia
l 20×garbiketa-soluzio kontzentratua 40ml
…………………………………………..…txapel gardena
l 4 × erauzketa-soluzio kontzentratua 50ml
……………………………………………………….txapel urdina
7. Erreaktiboak prestatzea:
1. irtenbidea:0,1 mol/L NaOH disoluzioa
Pisatu 0,4 g NaOH 100 ml ur deionizatu eta guztiz nahastu.
2. irtenbidea: 1mol/L NaOH disoluzioa
Pisatu 4 g NaOH 100 ml ur deionizatutan eta nahastu guztiz.
3. irtenbidea: Karbonato buffer gatza
Irtenbidea1: 0,2M PB
51,6 g Na disolbatu2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O ur deionizatuarekin eta diluitu 1000 ml-ra.
Irtenbidea2: Erauzketa-soluzioa
Diluitu 2 × erauzketa kontzentratua ur deionizatuarekin 1:1 bolumen-erlazioan (adibidez, 2 × erauzketa-disoluzio 10ml + 10ml ur deionizatua), laginak ateratzeko erabiliko dena,irtenbide hau 4 ℃-tan gorde daiteke hilabetez.
Irtenbidea3: Garbitu disoluzioa
Diluitu 20 × garbiketa kontzentratua ur deionizatuarekin 1:19 bolumen proportzioan (adibidez, 20×garbiketa-disoluzioko 5ml + 95ml ur deionizatua), platerak garbitzeko erabiliko dena.Soluzio hau 4 ℃-tan gorde daiteke hilabetez.
8. Laginak prestatzea
8.1 Oharra eta neurriak martxan jarri aurretik:
(a) Mesedez, erabili behin-behineko aholkuak esperimentu prozesuan, eta aldatu aholkuak erreaktibo desberdinak xurgatzean.
(b) Ziurtatu tresna guztiak garbi daudela.
(c) Ehun-lagina izoztuta eduki.
(d) Prestatutako lagina saiakuntzarako erabili behar da aldi berean.
8.2 Animalien ehuna (oilaskoa, txerria, etab.)
----Homogeneizatu lagina homogeneizatzailearekin;
----Hartu 2,0 ± 0,05 g homogeneizatu 50 ml-ko poliestirenozko zentrifuga-hodi batean;gehitu 2 ml 0,2 M PB (irtenbidea1), astindu disolbatzeko, eta gero gehitu 8 ml etil azetato eta astindu gogor 3min;
---- Banatzeko zentrifugatzailea: 3000g / giro-tenperatura / 5min.
----Fase organiko gaindituaren 4 ml 10 ml beirazko hodi batera transferitu, lehortu 50-60 ℃ ur-bainuarekin nitrogeno gasaren korrontearen azpian;
---- Desegin hondarra lehorra n-hexano 1 mlrekin, zurrunbiloa 30 segundoz disolbatzeko eta, gero, erauzketa-soluzio 1 ml gehitu (irtenbidea2), zurrunbiloa 1min.Banatzeko zentrifugatzailea: 3000g / giro-tenperatura / 5min
----N-hexano fasea gainditzailea kendu;hartu substratuaren fase urtsuaren 50 μl azterketarako.
Diluzio-faktorea: 1
8.2 Esnea
---- Hartu 100μl esne gordina lagin, nahastu 900μl erauzketa soluzioarekin (irtenbidea2) eta guztiz nahastu.
----Hartu prestatutako disoluziotik 50μl azterketarako.
Diluzio-faktorea: 10
9. Saiakuntza-prozesua
9.1 Saiakuntzaren aurretik ohartarazi
9.1.1Ziurtatu erreaktibo eta mikroputzu guztiak giro-tenperaturan daudela (20-25 ℃).
9.1.2Itzuli gainerako erreaktibo guztiak 2-8ra℃erabili eta berehala.
9.1.3Mikroputzuak behar bezala garbitzea saiakuntza prozesuan urrats garrantzitsua da;ELISA analisiaren erreproduzigarritasunerako ezinbesteko faktorea da.
9.1.4 AInkubazioan argia hustu eta mikroputzuak estali.
9.2 Saiaketaren urratsak
9.2.1 Atera erreaktibo guztiak giro-tenperaturan (20-25 ℃) 30 minutu baino gehiagoz, astindu astiro erabili aurretik.
9.2.2 Atera behar diren mikroputzuak eta itzuli gainerakoa zip-lock-poltsan 2-8 ℃-ra berehala.
9.2.3 Diluitutako garbiketa-disoluzioa berriro berotu behar da giro-tenperaturan egon dadin erabili aurretik.
9.2.4Zenbakia:Mikroputzuen posizio guztiak zenbakituta eta estandar eta lagin guztiak bikoiztu egin behar dira.Grabatu estandarrak eta lagin-posizioak.
9.2.5Add soluzio estandarra/lagina eta antigorputz disoluzioa: Gehitu 50 µl disoluzio estandar ((kit eskaintzen da)) edo dagozkien putzuetara prestatutako lagina.Gehitu 50 µl antigorputz soluzio (kit eskaintzen da).Nahastu astiro-astiro plaka eskuz astinduz eta inkubatu 30 minutuz 37 ℃-tan estalkiarekin.
9.2.6Garbitu: Kendu estalkia astiro-astiro eta garbitu likidoa putzuetatik eta garbitu mikroputzuak 250 µl-ko disoluzio diluituarekin (irtenbidea3) 10 segundoko tartean 4-5 aldiz.Hondar-ura paper xurgatzailearekin xurgatu (gainerako aire-burbuila ezabatu daiteke erabili gabeko puntarekin).
9.2.7Gehitu entzima konjokatua: Gehitu 100 ml entzima konjugatu soluzio (kit eskaintzen da) putzu bakoitzean, astiro-astiro nahastu eta inkubatu 30 minutuz 37 ℃-tan estalkiarekin.Errepikatu garbiketa urratsa berriro.
9.2.8Kolorazioa: Gehitu 50 µl A disoluziokit eskaintzen da) eta 50µl disoluzio B(kit eskaintzen da) putzu bakoitzari.Nahastu astiro-astiro eta inkubatu 15 minutuz 37 ℃-tan estalkiarekin.
9.2.9Neurria: Gehitu 50 µl stop-disoluzioaren (kit eskaintzen da) putzu bakoitzari.Nahastu astiro-astiro eta neurtu absorbantzia 450nm-n (450/630nm-ko uhin-luzera bikoitzean neurtzea gomendatzen da. Irakurri emaitza 5 minuturen buruan gelditzeko soluzioa gehitu ondoren).
10. Emaitzak
10.1 Ehuneko xurgapena
Estandarretarako eta laginetarako lortutako absorbantzia-balioen batez besteko balioak lehenengo estandarraren (zero estandar) absorbantzia-balioarekin zatitzen dira eta % 100ean biderkatu.Zero estandarra % 100aren berdina egiten da eta absorbantzia-balioak ehunekotan adierazten dira.
B
Xurgapena (%) = —— ×% 100
B0
B ——xurgantzia estandarra (edo lagina)
B0 ——absorbantzia zero estandarra
10.2 Kurba estandarra
----Kurba estandar bat marrazteko: Hartu estandarren absorbantzia-balioa y ardatz gisa, tilosinaren estandar-disoluzioaren (ppb) kontzentrazio erdi logaritmikoa x ardatz gisa.
----Lagin bakoitzaren tilosinaren kontzentrazioa (ppb), kalibrazio-kurbatik irakur daitekeena, jarraitutako lagin bakoitzaren dagokion Diluzio-faktorearekin biderkatzen da, eta laginaren benetako kontzentrazioa lortzen da.
Kontuan izan:
Datuen analisirako software berezia garatu da, eskatuz gero eman daitekeena.
11. Sentikortasuna, zehaztasuna eta zehaztasuna
Proba sentikortasuna:1,5 ppb
Detektatzeko muga:
Animalien ehuna…………………………………………………… 1,5 ppb Esnea……………………………………………………………..15 ppb Zehaztasuna:
Animalien ehuna………………………………………………% 80±15
Esnea………………………………………..……….……%80±10
Zehaztasuna:
ELISA kitaren aldakuntza-koefizientea % 10 baino txikiagoa da.
12. Oharra
12.1 Estandarretarako eta laginetarako lortutako absorbantzia-balioen batez besteko balioak murriztuko dira erreaktiboak eta laginak giro-tenperaturan (20-25 ℃) erregulatu ez badira.
12.2 Ez utzi mikroputzuak lehortzen urratsen artean, arrakastarik gabeko erreproduzigarritasuna saihesteko eta egin hurrengo urratsa mikroputzuen euskarria kolpatu eta berehala.
12.3 Erabili aurretik, astindu leunki erreaktibo bakoitza.
12.4 Mantendu zure larruazala gelditzeko irtenbidetik 0,5MH-koa baita2SO4irtenbidea.
12.5 Ez erabili kitak zaharkituta.Ez trukatu sorta desberdinetako erreaktiboak, bestela, sentsibilitatea jaitsi egingo da.
12.6 Mantendu ELISA kitak 2-8 ℃-tan, ez izoztu.Zigilatu gainerako mikroputzuen plakak, saihestu eguzki-argia zuzena inkubazio guztietan.Mikrotitulazioko plakak estaltzea gomendatzen da.
12.7 Substratuaren disoluzioa alde batera utzi behar da koloreak hartzen baditu.Erreaktiboak txartu egin daitezke, zero estandarraren absorbantzia-balioa (450/630nm) 0,5 (A450nm <0,5) baino txikiagoa bada.
12.8 Kolorazio-erreakzioak A disoluzioa eta B disoluzioa gehitu ondoren 15 minutu behar ditu. Eta inkubazio-denbora 20 minutu edo gehiagora luza dezakezu kolorea argiegia bada zehazteko.Inoiz ez gainditu 30min, aitzitik, laburtu inkubazio denbora behar bezala.
12.9 Erreakzio-tenperatura optimoa 37 ℃ da.Tenperatura handiagoak edo baxuagoak sentikortasun eta absorbantzia balioen aldaketak ekarriko ditu.
13. Biltegiratzea
Biltegiratze egoera: 2-8 ℃.
Biltegiratzeko epea: 12 hilabete.
