produktua

Proba-printzipioa

Kit hau zeharkako lehiako ELISA teknologian oinarritzen da.Mikrotitulazio-hobiak akoplamendu-antigenoz estalita daude.Flumekinalaginaren hondarra antigorputzaren mikrotitulazio-plakan estalitako antigenoarekin lehiatzen da.Antigorputzak markatutako entzimak gehitu ondoren, TMB substratua erabiltzen da kolorea erakusteko.Laginaren xurgapena negatiboki erlazionatuta dago bertan dagoen tetraziklina-hondakinarekin, Kurba Estandarrarekin alderatu ondoren, diluzio-multiploarekin biderkatuta, laginaren Flumequine hondakin-kantitatea kalkula daiteke.

Aplikazioak

Kit hau eztian flumequine hondakinen analisi kuantitatibo eta kualitatiboetan erabil daiteke.

Erreakzio gurutzatuak

Flumequine ………………………………………………… % 100

Beharrezko materialak

Ekipamenduak

┅┅Mikrotitulazio plaka espektrofotometroa (450nm/630nm)

┅┅Homogeneizatzailea edo urdaila

┅┅Shaker

┅┅Vortex nahasgailua

┅┅ Zentrifugatzailea

┅┅Oreka analitikoa (induktantzia: 0,01 g)

┅┅Pipeta graduatua: 15ml

┅┅Gomazko pipeta-bonbilla

┅┅Polestirenozko zentrifuga-tutua: 15ml, 50ml

┅┅Beirazko probeta: 10 ml

┅┅Mikropipetak: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,

250ml -multipipette

Erreaktiboak

┅┅n-hexano (AR)

┅┅Metileno kloruroa (AR)

┅┅Azetonitrilo (AR)

┅┅Ura desionizatua

-----Azido klorhidriko kontzentratua (AR)

Kitaren osagaiak

● Antigenoz estalitako 96 putzudun mikrotitulazio-plaka

● Soluzio estandarrak (6 botila × 1 ml/botila)

0ppb, 0.3ppb, 1.2ppb, 4.8ppb, 19.2ppb, 76.8ppb

● Kontzentrazio handiko kontrol estandarra: (1 ml/botila)

……………………………………………………………100ppb

● Entzima konjokatua 12ml……………... txano gorria

● Antigorputz disoluzioa 7ml …………..……..….…..txapel berdea

● A disoluzioa 7ml……..…………………..………..txapel zuria

● B disoluzioa 7ml …………….…………..………… txano gorria

● Stop disoluzioa 7ml ……………………………..………txapel horia

● 20XGarbiketa-soluzio kontzentratua 40ml

………………………………………..…..txapel gardena

●2X Erauzketa-disoluzioa 50ml……………………………… txapel urdina

Erreaktiboak prestatzea

7.1 Ezti-lagina

1 disoluzioa : 0,2 M azido klorhidriko disoluzioa

Pisua 41,5 ml Azido klorhidriko kontzentratua, ur deionizatuarekin diluitu 500 ml-ra.

2. irtenbidea: Garbitu disoluzioa

Garbiketa kontzentratua ur deionizatuarekin diluitu 1:19 bolumen proportzioan, plakak garbitzeko erabiliko dena.disoluzio diluitua 4 ℃-tan gorde daiteke hilabetez.

Irtenbidea3: erauzketa-disoluzioa

Diluitu 2 × erauzketa-soluzio kontzentratua ur deionizatuarekin 1:1eko bolumen proportzioan (edo eskakizunaren arabera), laginak ateratzeko erabiliko dena.Disoluzio diluitu hau hilabetez kontserba daiteke 4 ℃-tan.

Laginak prestatzea

8.1 Erabiltzaileentzako oharrak eta neurriak funtzionatu aurretik

(a) Mesedez, erabili behin-behineko aholkuak esperimentu prozesuan, eta aldatu aholkuak erreaktibo desberdinak xurgatzean.

(b) Ziurtatu tresna esperimental guztiak garbi daudela, bestela azterketaren emaitza eragingo du.

8.2Ezti lagina

----- Pisatu 2 g ± 0,05 g ezti lagina 50 ml poliestirenozko zentrifuga-hodi batean,

----- Gehitu 2 ml 0,2 M azido klorhidrikoko disoluzioa (1. soluzioa), zurrunbiloa guztiz nahasteko, gero 8 ml metileno kloruroa gehitu, astindu astinduarekin 5 minutuz guztiz desegiteko;

----- Zentrifugatu 10 minutuz, gutxienez 3000 g giro-tenperaturan (20-25 ℃);

-----Kendu gaindiko fasea, eraman substratuaren disoluzio organikoaren 2 ml 10 ml-ko beirazko hodi batera. Lehortu azpiegoera Nitrogeno-fluxuaren (50-60 ℃) ur-bainupean.

----- Gehitu 1 ml n-hexano, zurrunbiloa 30 segundoz, gero gehitu 1 ml erauzketa-disoluzioa (3. soluzioa), berriro zurrunbiloa 1 min.Zentrifugatu 5 minutuz, gutxienez 3000 g giro-tenperaturan (20-25 ℃);

-----Kendu gaindiko fasea, hartu 50ml azterketarako;

9. Saiakuntza-prozesua

9.1 Saiakuntzaren aurretik ohartarazi

9.1.1 Ziurtatu erreaktibo eta mikroputzu guztiak giro-tenperaturan daudela (20-25 ℃).

9.1.2 Itzuli gainerako erreaktibo guztiak 2-8 ℃-ra erabili eta berehala.

9.1.3 Mikroputzuak behar bezala garbitzea saiakuntza prozesuan urrats garrantzitsua da;ELISA analisiaren errepikakortasunerako ezinbesteko faktorea da.

9.1.4 Inkubazioan argia saihestu eta mikroputzuak estali.

9.2 Saiaketaren urratsak

9.2.1 Atera erreaktibo guztiak giro-tenperaturan (20-25 ℃) 30 min baino gehiagoz, homogeneizatu erabili aurretik.

9.2.2 Atera behar diren mikroputzuak eta itzuli gainerakoa zip-lock-poltsan 2-8 ℃-ra berehala.

9.2.3 Diluitutako garbiketa-disoluzioa berriro berotu behar da giro-tenperaturan egon dadin erabili aurretik.

9.2.4Zenbakia:Zenbaki mikroputzuen posizio bakoitza eta estandar eta lagin guztiak bikoiztu egin behar dira.Grabatu estandarrak eta lagin-posizioak.

9.2.5Gehitu soluzio/lagina estandarra:Gehitu 50 µl disoluzio estandar edo prestatutako lagin dagozkion putzuetan.Gehitu 50 µl antigorputz disoluzioa.Nahastu astiro-astiro plaka eskuz astinduz eta inkubatu 30 minutuz 25 ℃-tan estalkiarekin.

9.2.6Garbitu:Kendu estalkia astiro-astiro eta garbitu likidoa putzuetatik eta garbitu mikroputzuak 250 µl-ko disoluzio diluituarekin (2. disoluzioa) 10 segundoko tartean 4-5 aldiz.Hondar-ura paper xurgatzailearekin xurgatu (gainerako aire-burbuila ezabatu daiteke erabili gabeko puntarekin).

9.2.8.Entzima konjokatua:Gehitu 100 ml entzima konjokatu-soluzioa putzu bakoitzean, nahastu astiro-astiro plaka eskuz astinduz eta inkubatu 30 minutuz 25 ℃-tan estalkiarekin.Errepikatu garbiketa urratsa berriro.

9.2.8Kolorea:Gehitu 50 µl A disoluzioa eta 50 µl B disoluzioa putzu bakoitzean.Nahastu astiro-astiro plaka eskuz astinduz eta inkubatu 15 minutuz 25 ℃-tan estalkiarekin (ikus 12.8).

9.2.9Neurria:Gehitu 50 µl stop-disoluzioa putzu bakoitzean.Nahastu astiro-astiro plaka eskuz astinduz eta neurtu 450 nm-ko xurgapena aire hutsune baten aurka (450/630 nm-ko uhin-luzera bikoitzean neurtzea gomendatzen da. Irakurri emaitza gelditzeko soluzioa gehitu eta 5 minutuko epean. ) (Bistaz ere neur dezakegu. gelditu irtenbiderik gabe ELIASA tresnaren laburpenaz)

Emaitzak

10.1 Ehuneko xurgapena

Estandarretarako eta laginetarako lortutako absorbantzia-balioen batez besteko balioak lehen estandarraren (zero estandar) xurgantzia-balioarekin zatitzen dira eta % 100ean biderkatu.Zero estandarra % 100aren berdina egiten da eta absorbantzia-balioak ehunekotan adierazten dira.

Xurgapena (%) = B/B0 ×% 100

B ——xurgantzia estandarra (edo lagina)

B0 ——absorbantzia zero estandarra

10.2 Kurba estandarra

Kurba estandar bat marrazteko: Hartu estandarren absorbantzia-balioa y-ardatz gisa, flumequine estandar-disoluzioaren (ppb) kontzentrazio erdi logaritmikoa x-ardatz gisa.

--- TheflumekinaLagin bakoitzaren kontzentrazioa (ppb), kalibrazio-kurbatik irakur daitekeena, jarraitutako lagin bakoitzaren dagokion diluzio-multiploarekin biderkatu eta laginaren benetako kontzentrazioa lortzen da.

ELISA kit-en datuak murrizteko, software berezia garatu da, eskatuz gero eman daitekeena.

11. Sentikortasuna, zehaztasuna eta zehaztasuna

Proba Sentsibilitatea:0,3 ppb

Eztia Laginaren diluzio-faktorea: 2

Detekzio muga

Ezti lagina------------------------------------------------ -1ppb

Zehaztasuna

Ezti lagina -------------------------------------------- 90±20 %

Zehaztasuna

ELISA kitaren aldakuntza-koefizientea % 10 baino txikiagoa da.

12. Oharra

12.1 Estandarretarako eta laginetarako lortutako absorbantzia-balioen batez besteko balioak murriztuko dira erreaktiboak eta laginak giro-tenperaturan (20-25 ℃) erregulatu ez badira.

12.2 Ez utzi mikroputzuak lehortzen urratsen artean, arrakastarik gabeko errepikapena saihesteko eta egin hurrengo urratsa mikroputzuen euskarria kolpatu eta berehala.

12.3.Homogeneizatu erreaktibo bakoitza erabili aurretik.

12.4.Mantendu zure azala gelditzeko irtenbidetik urrun, 2M H delako₂SO₄irtenbidea.

12.5 Ez erabili kitak zaharkituta.Ez trukatu sorta ezberdinetako erreaktiboak, sentsibilitatea jaitsi egingo baita.

12.6 Biltegiratzeko egoera:

Mantendu ELISA kitak 2-8 ℃-tan, ez izoztu.Zigilatu gainerako mikrohobi plakak Inkubazio guztietan eguzki-argia zuzena saihestu.Mikrotitulazioko plakak estaltzea gomendatzen da.

12.7 Erreaktiboen okerreraren zantzuak:

Substratuaren soluzioa alde batera utzi behar da koloreak hartzen baditu.

Erreaktiboak txarrak izan daitezke, zero estandarraren absorbantzia-balioa (450/630nm) 0,5 (A450nm<0,5) baino txikiagoa bada.

12.8 Kolorazio-erreakzioak 15 minutu behar ditu A disoluzioa eta B disoluzioa gehitu ondoren. Eta inkubazio-denbora 20 minututik gehiago luza dezakezu kolore argiegia bada zehazteko.Inoiz ez gainditu 25min, Aitzitik, laburtu inkubazio denbora behar bezala.

12.9 Erreakzio-tenperatura optimoa 25 ℃ da.Tenperatura handiagoak edo baxuagoak sentikortasun eta absorbantzia balioen aldaketak ekarriko ditu.

13. Biltegiratzea

Biltegiratze egoera: 2-8 ℃.

Biltegiratzeko epea: 12 hilabete.