طقم المقايسة المناعية الإنزيمية التنافسية للتحليل الكمي للفلوميكوين
مبدأ الاختبار
تعتمد هذه المجموعة على تقنية ELISA التنافسية غير المباشرة.يتم تغطية آبار ميكروترتير مع مستضد اقتران.فلوميكينالبقايا في العينة تتنافس مع المستضد المطلي على لوحة microtiter للجسم المضاد.بعد إضافة الإنزيم المسمى بالجسم المضاد ، يتم استخدام ركيزة TMB لإظهار اللون.يرتبط امتصاص العينة سلبًا بالتتراسيكلين الموجود فيها ، بعد المقارنة مع المنحنى القياسي ، مضروبًا في مضاعف التخفيف ، ويمكن حساب كمية بقايا Flumequine في العينة.
التطبيقات
يمكن استخدام هذه المجموعة في التحليل الكمي والنوعي لبقايا flumequine في العسل.
ردود الفعل المتصالبة
فلوميكين …………………… .. ………………………… 100٪
المواد المطلوبة
المعدات
┅┅ مقياس الطيف الضوئي ذو الألواح الدقيقة (450 نانومتر / 630 نانومتر)
┅┅ الهوموجينيزر أو المعدة
شاكر
┅┅Vortex خلاط
┅┅ أجهزة الطرد المركزي
ميزان تحليلي (الحث: 0.01 جم)
┅┅ ماصة متدرجة: 15 مللي
لمبة ماصة المطاط
أنبوب البوليسترين للطرد المركزي: 15 مل ، 50 مل
أنبوب اختبار زجاج ： 10 مل
الماصات الدقيقة: 20 مل -200 مل ، 100 مل -10000 مل ،
250 مل - متعدد الماصات
الكواشف
┅┅n- الهكسان (AR)
┅┅ كلوريد الميثيلين (AR)
┅┅ الأسيتونيتريل (AR)
┅┅ ماء منزوع الأيونات
----- حمض الهيدروكلوريك المركز (AR)
مكونات الطقم
● صفيحة ميكروترية تحتوي على 96 بئراً مطلية بمستضد
● محاليل قياسية (6 زجاجات × 1 مل / زجاجة)
0ppb ، 0.3ppb ، 1.2ppb ، 4.8ppb ، 19.2ppb ، 76.8ppb
● التحكم القياسي عالي التركيز: (1 مل / زجاجة)
………………………………………………………… ......100 جزء في المليون
● الإنزيم المتقارن 12 مل .............................. غطاء أحمر
● محلول الجسم المضاد 7 مل ………… .. …… ..….… .. غطاء أخضر
● الحل أ 7 مل ............. .............................. .............. غطاء أبيض
● الحل B 7 مل .................. .................. قبعة حمراء
● توقف الحل 7 مل ...................... قبعة صفراء
● 20X محلول غسيل مركز 40 مل
……………………………………… ..… .. غطاء شفاف
● 2X محلول استخلاص 50 مل .................. ... غطاء أزرق
تحضير الكواشف
7.1 عينة العسل
الحل 1: 0.2 مولار من محلول حمض الهيدروكلوريك
الوزن 41.5 مل حمض الهيدروكلوريك المركز ، يخفف بالماء منزوع الأيونات حتى 500 مل.
الحل 2: محلول الغسل
قم بتخفيف محلول الغسيل المركز بالماء منزوع الأيونات بنسبة حجم 1: 19 ، والتي سيتم استخدامها لغسل الأطباق.يمكن تخزين المحلول المخفف عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
المحلول3: محلول الاستخلاص
قم بتخفيف محلول الاستخراج المركز 2 × بالماء منزوع الأيونات بكمية حجم 1: 1 (أو حسب المتطلبات) ، والتي سيتم استخدامها لاستخراج العينة.يمكن حفظ هذا المحلول المخفف لمدة شهر عند 4 ℃.
تحضيرات العينة
8.1 ملاحظات واحتياطات للمستخدمين قبل العملية
(أ) يرجى استخدام النصائح لمرة واحدة في عملية التجربة ، وتغيير النصائح عند امتصاص كاشف مختلف.
(ب) تأكد من أن جميع الأدوات التجريبية نظيفة ، وإلا فإنها ستؤثر على نتيجة الفحص.
8.2عينة العسل
----- تزن 2 جم ± 0.05 جم عينة عسل في أنبوب طرد مركزي من البوليسترين سعة 50 مل ،
----- أضف 2 مل 0.2 م من محلول حمض الهيدروكلوريك (المحلول 1) ، ودوامة لخلطها تمامًا ، ثم أضف 8 مل كلوريد الميثيلين ، ورجها باستخدام شاكر لمدة 5 دقائق لتذوب تمامًا ؛
----- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق ، 3000 جم على الأقل في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ؛
----- قم بإزالة المرحلة الطافية ، خذ 2 مل من محلول الركيزة العضوي في أنبوب زجاجي 10 مل. جفف المادة الفرعية تحت حمام مائي لتدفق النيتروجين (50-60 ℃)
----- أضف 1 مل n-hexane ، دوامة لمدة 30 ثانية ، ثم أضف 1 مل من محلول الاستخراج (محلول 3) ، دوامة مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة.جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق ، 3000 جم على الأقل في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ؛
----- قم بإزالة المرحلة الطافية ، خذ 50 مل للمقايسة ؛
9. عملية الفحص
9.1 إشعار قبل الفحص
9.1.1 تأكد من أن جميع الكواشف والميكروويلات كلها في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).
9.1.2 أعد جميع الكواشف المتبقية إلى 2-8 ℃ فورًا بعد استخدامها.
9.1.3 يعد غسل ميكروويلس بشكل صحيح خطوة مهمة في عملية الفحص ؛إنه العامل الحيوي لتكرار تحليل ELISA.
9.1.4 تجنب الضوء وقم بتغطية الميكروويلات أثناء الحضانة.
9.2 خطوات الفحص
9.2.1 إخراج جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لأكثر من 30 دقيقة ، وتجانسها قبل الاستخدام.
9.2.2 قم بإخراج الميكروويلات اللازمة وأعد الباقي إلى كيس السحاب بدرجة حرارة 2-8 ℃ على الفور.
9.2.3 يجب إعادة تسخين محلول الغسل المخفف إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
9.2.4عدد:رقم كل موضع ميكروويل وجميع المعايير والعينات يجب تشغيلها في نسختين.سجل المعايير والمواقف العينات.
9.2.5أضف محلولًا / نموذجًا قياسيًا:أضف 50 ميكرولتر من المحلول القياسي أو العينة المعدة إلى الآبار المقابلة.أضف 50 مايكرولتر من محلول الجسم المضاد.امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع الغطاء.
9.2.6غسل:انزع الغطاء برفق ونقي السائل من الآبار واشطف الميكروويلات بمحلول غسيل مخفف سعة 250 ميكرولتر (محلول 2) بفاصل 10 ثوانٍ لمدة 4-5 مرات.قم بامتصاص الماء المتبقي بورق ماص (يمكن التخلص من فقاعة الهواء المتبقية بطرف غير مستخدم).
9.2.8.إنزيم متقارن:أضف محلول الإنزيم المتقارن 100 مل لكل بئر ، امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع الغطاء.كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
9.2.8تلوين:أضف 50 مايكرولتر من المحلول أ و 50 مايكرولتر من المحلول ب لكل بئر.امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع غطاء (انظر 12.8).
9.2.9يقيس:أضف 50 مايكرولتر من محلول الإيقاف لكل بئر.امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا وقياس الامتصاص عند 450 نانومتر مقابل فراغ هوائي (يُقترح قياس بطول موجة مزدوج 450/630 نانومتر. اقرأ النتيجة في غضون 5 دقائق بعد إضافة محلول التوقف.) (يمكننا أيضًا القياس عن طريق البصر بدون حل توقف أقل من أداة ELIASA)
نتائج
10.1 نسبة الامتصاص
يتم تقسيم القيم المتوسطة لقيم الامتصاص التي تم الحصول عليها للمعايير والعينات على قيمة الامتصاصية للمعيار الأول (المعيار الصفري) ومضروبة في 100٪.وبذلك يصبح المعيار الصفري مساويًا لـ 100٪ وقيم الامتصاصية مقتبسة في النسب المئوية.
الامتصاصية (٪) = B / B0 × 100٪
ب- معيار الامتصاص (أو العينة)
B0 —— معيار الامتصاص الصفري
10.2 المنحنى القياسي
لرسم منحنى قياسي: خذ قيمة الامتصاصية للمعايير كمحور y ، شبه لوغاريتمي لتركيز محلول معايير flumequine (ppb) كمحور x.
--- الفلوميكينيتم ضرب تركيز كل عينة (جزء في البليون) ، والتي يمكن قراءتها من منحنى المعايرة ، في مضاعف التخفيف المقابل لكل عينة متبوعة ، ويتم الحصول على التركيز الفعلي للعينة.
لتقليل بيانات مجموعات ELISA ، تم تطوير برنامج خاص يمكن توفيره عند الطلب.
11. الحساسية والدقة والدقة
اختبار الحساسية：0.3ppb
عامل تخفيف عينة العسل: 2
حد الكشف
عينة العسل ------------------------------------------------ -1ppb
صحة
عينة العسل --------------------------------------------- 90 ± 20 ٪
دقة
معامل الاختلاف لمجموعة ELISA أقل من 10٪.
12. إشعار
12.1 سيتم تقليل القيم المتوسطة لقيم الامتصاص التي تم الحصول عليها للمعايير والعينات إذا لم يتم تنظيم الكواشف والعينات لدرجة حرارة الغرفة (20-25).
12.2 لا تدع الميكروويلات تجف بين الخطوات لتجنب التكرار غير الناجح وقم بتشغيل الخطوة التالية مباشرة بعد النقر على حامل الميكروويلس.
12.3.قم بتجانس كل كاشف قبل استخدامه.
12.4.حافظ على بشرتك بعيدًا عن محلول الإيقاف لأنه 2M H.2SO4المحلول.
12.5 لا تستخدم مجموعات قديمة.لا تتبادل الكواشف من دفعات مختلفة ، لأنها ستسقط الحساسية.
12.6 حالة التخزين:
احتفظ بمجموعات ELISA عند 2-8 ℃ ، لا تجمد.ختم لوحات microwell بقية تجنب ضوء الشمس المباشر خلال جميع الحضانات.يوصى بتغطية ألواح الميكروتيتر.
12.7 مؤشرات سوء الكواشف:
يجب التخلي عن محلول الركيزة إذا تحول الألوان.
قد تصبح الكواشف سيئة إذا كانت قيمة الامتصاصية (450/630 نانومتر) لمعيار الصفر أقل من 0.5 (A450 نانومتر ＜ 0.5).
12.8 يحتاج تفاعل التلوين إلى 15 دقيقة بعد إضافة المحلول أ والحل ب. ويمكنك إطالة نطاقات وقت الحضانة من 20 دقيقة إلى أكثر إذا كان اللون فاتحًا جدًا بحيث يتعذر تحديده.لا تتعدى الـ 25 دقيقة ، بل على العكس تقصير مدة الحضانة بالشكل الصحيح.
12.9 درجة حرارة التفاعل المثلى هي 25.سيؤدي ارتفاع درجة الحرارة أو انخفاضها إلى تغيرات في قيم الحساسية والامتصاص.
13. التخزين
حالة التخزين: 2-8 ℃.
فترة التخزين: 12 شهر.
