מוצר

עקרון הבדיקה

ערכה זו מבוססת על טכנולוגיית ELISA תחרותית עקיפה.בארות המיקרוטיטר מצופות באנטיגן צימוד.פלומקוויןשאריות בדגימה מתחרות עם האנטיגן המצופה בצלחת המיקרוטיטר על הנוגדן.לאחר הוספה של אנטי-נוגדן המסומן באנזים, נעשה שימוש במצע TMB כדי להראות את הצבע.ספיגת הדגימה קשורה לרעה לטטרציקלין השוכן בה, לאחר השוואה עם עקומת הסטנדרט, כפול מכפלת הדילול, ניתן לחשב את כמות שאריות הפלומקווין בדגימה.

יישומים

ערכה זו יכולה לשמש בניתוח כמותי ואיכותי של שאריות פלומקווין בדבש.

תגובות צולבות

Flumequine ………………………………………………… 100%

חומרים נדרשים

ציוד

┅┅ספקטרופוטומטר לוחות מיקרוטיטר (450nm/630nm)

┅┅הומגניזר או קיבה

┅┅שייקר

┅┅מערבל מערבולת

┅┅צנטריפוגה

┅┅איזון אנליטי (השראות: 0.01 גרם)

┅┅פיפטה מדורגת: 15 מ"ל

┅┅נורת פיפטה מגומי

┅┅שפופרת צנטריפוגה פוליסטירן: 15 מ"ל, 50 מ"ל

┅┅מבחנה מזכוכית: 10 מ"ל

┅┅מיקרופיפטות: 20 מ"ל-200 מ"ל, 100 מ"ל -10000 מ"ל,

250 מ"ל -מולטיפיפטה

ריאגנטים

┅┅n-hexane(AR)

┅┅מתילן כלוריד (AR)

┅┅Acetonitrile(AR)

┅┅מים דה-יונים

----- חומצה הידרוכלורית מרוכזת (AR)

רכיבי ערכה

● צלחת מיקרוטיטר עם 96 בארות מצופה באנטיגן

● פתרונות סטנדרטיים (6 בקבוקים×1 מ"ל/בקבוק)

0ppb, 0.3ppb, 1.2ppb, 4.8ppb, 19.2ppb, 76.8ppb

● בקרה סטנדרטית בריכוז גבוה: (1 מ"ל/בקבוק)

…………………………………………………………………100ppb

● מצומד אנזים 12 מ"ל…………………………... מכסה אדומה

● תמיסת נוגדנים 7 מ"ל …………..……..….…..מכסה ירוק

● תמיסה A 7ml……..………………………………………..מכסה לבן

● תמיסה B 7 מ"ל ………………….…………..………… מכסה אדומה

● תמיסת עצור 7 מ"ל …………………………..………מכסה צהוב

● 20X תמיסת כביסה מרוכזת 40 מ"ל

…………………………………………..…..כובע שקוף

●2X תמיסת מיצוי 50 מ"ל……………………………… מכסה כחולה

הכנת ריאגנטים

7.1 דגימת דבש

פתרון 1: 0.2M תמיסת חומצה הידרוכלורית

משקל 41.5 מ"ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת, לדלל במים מפושטים ל-500 מ"ל.

פתרון 2: תמיסת כביסה

יש לדלל את תמיסת הכביסה המרוכזת במים דה-יונים ביחס נפח של 1:19, שישמשו לשטיפת הצלחות.ניתן לאחסן את התמיסה המדוללת בטמפרטורה של 4℃ למשך חודש אחד.

פִּתָרוֹן3: פתרון מיצוי

יש לדלל את תמיסת המיצוי המרוכזת 2× במים דה-יוניים במנת נפח של 1:1 (או תלוי בדרישה), אשר ישמשו למיצוי מדגם.ניתן לשמור תמיסה מדוללת זו למשך חודש בטמפרטורה של 4℃.

הכנות לדוגמא

8.1 הודעה ואמצעי זהירות למשתמשים לפני ההפעלה

(א) אנא השתמש בעצות חד פעמיות בתהליך הניסוי, ושנה את העצות כאשר סופגים ריאגנט אחר.

(ב) ודא שכל מכשירי הניסוי נקיים, אחרת זה ישפיע על תוצאת הבדיקה.

8.2דגימת דבש

-----שקול דגימת דבש של 2g±0.05g לתוך צינור צנטריפוגה של פוליסטירן בנפח 50 מ"ל,

----- הוסף 2 מ"ל 0.2 M תמיסת חומצה הידרוכלורית (פתרון 1), מערבב כדי לערבב אותה לחלוטין, ולאחר מכן הוסף 8 מ"ל מתילן כלוריד, נער עם שייקר למשך 5 דקות כדי להתמוסס לחלוטין;

----- צנטריפוגה למשך 10 דקות, לפחות 3000 גרם בטמפרטורת החדר (20-25℃);

-----הסר את שלב הסופרנטנט, קח 2 מ"ל מהתמיסה האורגנית של המצע לצינור זכוכית של 10 מ"ל. יבש את התשתית מתחת לאמבט מים של זרימת חנקן (50-60℃)

----- הוסף 1 מ"ל n-הקסאן, מערבולת במשך 30 שניות, ולאחר מכן הוסף 1 מ"ל תמיסת מיצוי (פתרון 3), לערבב שוב למשך 1 דקה.צנטריפוגה למשך 5 דקות, לפחות 3000 גרם בטמפרטורת החדר (20-25℃);

-----הסר את שלב הסופרנטנט, קח 50 מ"ל לבדיקה;

9. תהליך בדיקה

9.1 הודעה לפני הבדיקה

9.1.1 ודא שכל הריאגנטים והמיקרובארות נמצאים כולם בטמפרטורת החדר (20-25℃).

9.1.2 החזר את כל שאר הריאגנטים ל-2-8℃ מיד לאחר השימוש.

9.1.3 שטיפה נכונה של המיקרובארות היא שלב חשוב בתהליך הבדיקה;זהו הגורם החיוני לחזרתיות של ניתוח ELISA.

9.1.4 הימנע מהאור וכסה את בארות המיקרו במהלך הדגירה.

9.2 שלבי בדיקה

9.2.1 הוצא את כל הריאגנטים בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך יותר מ-30 דקות, הומוג לפני השימוש.

9.2.2 הוציאו את המיקרובארות הדרושים והחזרו את השאר לתוך שקית הנעילה בטמפרטורה של 2-8℃ מיד.

9.2.3 יש לחמם מחדש את תמיסת הכביסה המדוללת כך שתהיה בטמפרטורת החדר לפני השימוש.

9.2.4מספר:מספר כל עמדת microwell ויש להפעיל את כל התקנים והדגימות בשני עותקים.רשום את התקנים ואת עמדות הדוגמאות.

9.2.5הוסף פתרון/דוגמה סטנדרטית:הוסף 50 μl של תמיסה סטנדרטית או דגימה מוכנה לבארות המתאימות.הוסף תמיסת נוגדנים של 50 µl.מערבבים בעדינות על ידי ניעור הצלחת ידנית ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25℃ עם מכסה.

9.2.6לִשְׁטוֹף:הסר את הכיסוי בעדינות וטהור את הנוזל מהבארות ושטוף את המיקרובארות עם תמיסת שטיפה מדוללת (פתרון 2) במרווח של 10 שניות במשך 4-5 פעמים.ספג את שאריות המים בנייר סופג (ניתן לסלק את בועת האוויר הנותרת עם קצה לא בשימוש).

9.2.8.צמוד אנזים:הוסף תמיסת אנזים מצומדת 100 מ"ל לכל באר, ערבב בעדינות על ידי ניעור הצלחת ידנית ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25℃ עם מכסה.חזור על שלב הכביסה שוב.

9.2.8צבע:הוסף 50µl תמיסה A ו-50µl תמיסה B לכל באר.מערבבים בעדינות על ידי ניעור הצלחת ידנית ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25℃ עם מכסה (ראה 12.8).

9.2.9מידה:הוסף 50µl תמיסת העצירה לכל באר.מערבבים בעדינות על ידי ניעור הצלחת ידנית ומדוד את הספיגה ב-450 ננומטר מול ריק אוויר (מוצע למדוד עם אורך גל כפול של 450/630 ננומטר. קרא את התוצאה תוך 5 דקות לאחר הוספת תמיסת הפסקה. ) (אנו יכולים למדוד גם באמצעות ראייה ללא פתרון עצירה בקצרה של מכשיר ELIASA)

תוצאות

10.1 אחוזי ספיגה

הערכים הממוצעים של ערכי הספיגה המתקבלים עבור התקנים והדגימות מחולקים בערך הספיגה של התקן הראשון (תקן אפס) ומכפילים ב-100%.לפיכך, תקן האפס שווה ל-100% וערכי הספיגה מצוינים באחוזים.

ספיגה (%) = B/B0 ×100%

B - תקן ספיגה (או מדגם)

B0 ——תקן ספיגה אפס

10.2 עקומה סטנדרטית

כדי לצייר עקומה סטנדרטית: קח את ערך הספיגה של תקנים כציר y, חצי לוגריתמי של ריכוז תמיסת הסטנדרטים הפלומקווין (ppb) כציר x.

--- הflumequineהריכוז של כל דגימה (ppb), שניתן לקרוא מעקומת הכיול, מוכפל בכפולת הדילול המתאימה של כל דגימה שאחריה, ומתקבל הריכוז האמיתי של הדגימה.

להפחתת נתונים של ערכות ELISA פותחה תוכנה מיוחדת, הניתנת לספק לפי בקשה.

11. רגישות, דיוק ודיוק

רגישות למבחן:0.3ppb

גורם דילול דגימת דבש: 2

מגבלת זיהוי

דגימת דבש------------------------------------------------- -1ppb

דיוק

דגימת דבש -------------------------------------------- 90±20 %

דיוק

מקדם השינוי של ערכת ELISA הוא פחות מ-10%.

12. שימו לב

12.1 הערכים הממוצעים של ערכי הספיגה שהתקבלו עבור התקנים והדגימות יופחתו אם הריאגנטים והדגימות לא הווסתו לטמפרטורת החדר (20-25℃).

12.2 אל תאפשר למיקרו-בארות להתייבש בין השלבים כדי למנוע חזרתיות לא מוצלחת והפעל את השלב הבא מיד לאחר הקשה על מחזיק המיקרו-בארות.

12.3.הומגניז כל מגיב לפני השימוש.

12.4.הרחיקו את העור מתמיסת העצירה שכן היא ה-2M H₂SO₄פִּתָרוֹן.

12.5 אל תשתמש בערכות לא מעודכנות.אל תחליף ריאגנטים של אצוות שונות, כי זה יפיל את הרגישות.

12.6 מצב אחסון:

שמור את ערכות ELISA בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס, אין להקפיא.אטום צלחות microwell מנוחה הימנע מאור שמש ישר במהלך כל הדגירות.מומלץ לכסות את לוחות המיקרוטיטר.

12.7 אינדיקציות לכך שהריאגנטים מתקלקלים:

יש לנטוש תמיסת מצע אם הוא הופך לצבעים.

הריאגנטים עלולים להיות גרועים אם ערך הספיגה (450/630 ננומטר) של תקן האפס נמוך מ-0.5 (A450 ננומטר ~0.5).

12.8 תגובת הצביעה צריכה 15 דקות לאחר הוספת תמיסה A ופתרון B. ואתה יכול להאריך את טווחי זמן הדגירה בין 20 דקות ליותר אם הצבע בהיר מדי כדי לקבוע.לעולם אל תעלה על 25 דקות, להיפך, קצר את זמן הדגירה כראוי.

12.9 טמפרטורת התגובה האופטימלית היא 25℃.טמפרטורה גבוהה או נמוכה יותר תוביל לשינויים של ערכי הרגישות והספיגה.

13. אחסון

מצב אחסון: 2-8 ℃.

תקופת אחסון: 12 חודשים.