pwodwi

Prensip tès la

Twous sa a baze sou teknoloji ELISA endirèk-konpetitif.Pwi microtiter yo kouvwi ak antijèn kouple.Flumequinerezidi nan echantiyon an konkirans ak antijèn ki kouvri sou plak mikrotiter la pou antikò a.Apre adisyon a nan anzim ki make anti-antikò, yo itilize substra TMB pou montre koulè a.Se absorpsyon nan echantiyon an negatif ki gen rapò ak tetracycline a abite nan li, apre yo fin konpare ak koub la Creole, miltipliye pa dilution miltip la, Flumequine kantite rezidi nan echantiyon an ka kalkile.

Aplikasyon

Twous sa a ka itilize nan analiz quantitative ak kalitatif nan rezidi flumequine nan siwo myèl.

Reyaksyon kwaze

Flumequine ………………………………………………… 100%

Materyèl ki obligatwa

Ekipman

┅┅Microtiter plak espektwofotomèt (450nm/630nm)

┅┅Homogenizer oswa stomacher

┅┅Shaker

┅┅Vortex mixer

┅┅Santifij

┅┅Ekilib analitik (induktans: 0.01g)

┅┅Pipèt gradye: 15ml

┅┅Anpoul pipèt kawotchou

┅┅Polystyrène Tib Santrifij: 15ml, 50ml

┅┅Tib tès vè: 10ml

┅┅Mikropipèt: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,

250ml -multippèt

Reyaktif

┅┅n-hexane (AR)

┅┅Methylene klori (AR)

┅┅Acetonitrile (AR)

┅┅Dlo deyonize

-----Konsantre asid idroklorik (AR)

Konpozan Twous

● Plak mikrotiter ak 96 pwi ki kouvri ak antijèn

● Solisyon estanda (6 boutèy × 1ml / boutèy)

0ppb, 0.3ppb, 1.2ppb, 4.8ppb, 19.2ppb, 76.8ppb

● Segondè kontwòl estanda konsantrasyon: (1ml / boutèy)

……………………………………………………………100ppb

● Anzim konjige 12ml……………………... bouchon wouj

● Solisyon antikò 7ml …………..……..….…..bouchon vèt

● Solisyon A 7ml……..…………………..………..bouchon blan

● Solisyon B 7ml …………….…………..………… bouchon wouj

● Sispann solisyon 7ml ……………………………..………bouchon jòn

● 20XConcentrated lave solisyon 40ml

………………………………………..…..bouchon transparan

●2X solisyon ekstraksyon 50ml……………………………… bouchon ble

Preparasyon reyaktif

7.1 Echantiyon siwo myèl

Solisyon 1: 0.2 M solisyon asid idroklorik

Pwa 41.5ml Konsantre asid idroklorik, delye ak dlo deyonize a 500 ml.

Solisyon 2: Lave solisyon

Delye solisyon lave konsantre ak dlo deyonize nan rapò volim nan 1:19, ki pral itilize pou lave plak yo.solisyon an dilye ka estoke nan 4 ℃ pou 1 mwa.

Solisyon3: solisyon ekstraksyon

Delye 2 × solisyon ekstraksyon konsantre ak dlo deyonize nan volim 1:1 (oswa depann sou egzijans), ki pral itilize pou fè ekstraksyon echantiyon.Solisyon dilye sa a ka konsève pou 1 mwa nan 4 ℃.

Egzanp Preparasyon

8.1 Avi ak prekosyon pou itilizatè yo anvan operasyon an

(a) Tanpri sèvi ak konsèy yon sèl nan pwosesis la nan eksperyans, epi chanje konsèy yo lè absòbe diferan reyaktif.

(b) Asire w ke tout enstriman eksperimantal yo pwòp, otreman li pral afekte rezilta tès la.

8.2Echantiyon siwo myèl

----- Peze 2g±0.05g echantiyon siwo myèl nan yon tib santrifujeur 50ml polystyrène,

-----Ajoute 2ml 0.2 M solisyon asid idroklorik (Solisyon 1), toubiyon melanje li nèt, Lè sa a, ajoute 8ml klori metilèn, souke ak shaker pou 5min fonn nèt;

----- Santrifij pou 10 min, omwen 3000g nan tanperati chanm (20-25 ℃);

----- Retire faz supernatant la, pran 2 ml solisyon òganik substra a nan yon tib an vè 10 ml. Seche substate a anba beny dlo nan koule Azòt (50-60 ℃)

-----Ajoute 1 ml n-hexane, toubiyon pou 30s, Lè sa a, ajoute 1ml solisyon ekstraksyon (solisyon 3), toubiyon ankò pou 1min.Santrifije pou 5min, omwen 3000g nan tanperati chanm (20-25 ℃);

----- Retire faz supernatant la, pran 50ml pou tès;

9. Pwosesis tès

9.1 Avi anvan tès la

9.1.1 Asire w ke tout reyaktif ak microwells yo tout nan tanperati chanm (20-25 ℃).

9.1.2 Retounen tout rès reyaktif yo nan 2-8 ℃ imedyatman apre yo fin itilize yo.

9.1.3 Lave microwells yo kòrèkteman se yon etap enpòtan nan pwosesis tès la;li se faktè ki enpòtan anpil pou repete analiz ELISA.

9.1.4 Evite limyè a epi kouvri microwells yo pandan enkubasyon.

9.2 Etap tès yo

9.2.1 Retire tout reyaktif nan tanperati chanm (20-25 ℃) pou plis pase 30min, omojeneize anvan ou itilize.

9.2.2 Retire mikwo-puits ki nesesè yo epi retounen rès la nan sak zip-lock la nan 2-8 ℃ imedyatman.

9.2.3 Solisyon lave dilye a ta dwe rechofe pou li nan tanperati chanm anvan ou itilize.

9.2.4Nimewo:Nimewo chak pozisyon microwell ak tout estanda ak echantiyon yo ta dwe kouri an kopi.Ekri estanda yo ak pozisyon echantiyon yo.

9.2.5Ajoute solisyon estanda / echantiyon:Ajoute 50 µl solisyon estanda oswa echantiyon prepare nan pwi korespondan yo.Ajoute 50µl solisyon antikò.Melanje dousman pa souke plak la manyèlman epi enkube pou 30min nan 25 ℃ ak kouvèti.

9.2.6Lave:Retire kouvèti a dousman epi pi likid la soti nan pwi yo epi rense microwell yo ak 250µl solisyon lave dilye (solisyon 2) nan entèval 10s pou 4-5 fwa.Absòbe dlo rezidyèl la ak papye absòbe (ti ti wonn lè rès la ka elimine ak pwent ki pa itilize).

9.2.8.Konjige anzim:Ajoute solisyon konjige anzim 100ml nan chak pi, melanje dousman pa souke plak la manyèlman epi enkube pou 30min nan 25 ℃ ak kouvèti.Repete etap lave a ankò.

9.2.8Kolorasyon:Ajoute 50µl solisyon A ak 50µl solisyon B nan chak pi.Melanje dousman pa souke plak la manyèlman epi enkube pou 15 minit nan 25 ℃ ak kouvèti (gade 12.8).

9.2.9Mezi:Ajoute 50µl solisyon stop la nan chak pi.Melanje dousman pa souke plak la manyèlman epi mezire absòbe a nan 450nm kont yon lè vid (Li sijere mezire ak longèdonn nan doub nan 450/630nm. Li rezilta a nan 5min apre adisyon nan solisyon sispann. ) (Nou ka mezire tou pa je. san solisyon sispann nan kout enstriman ELIASA)

Rezilta yo

10.1 Pousantaj absòbe

Valè mwayen valè absòbe yo jwenn pou estanda yo ak echantiyon yo divize pa valè absòbe premye estanda (zewo estanda) epi miltipliye pa 100%.Se estanda zewo a ki egal a 100% ak valè absòbe yo site an pousantaj.

Absorbans (%) = B/B0 × 100%

B ——estanda absòpsyon (oswa echantiyon)

B0 ——absòbsyon zewo estanda

10.2 Koub Creole

Pou trase yon koub estanda: Pran valè absorbans estanda yo kòm aks y, semi-logaritmik nan konsantrasyon solisyon estanda flumequine (ppb) kòm aks x.

--- Aflumequinekonsantrasyon chak echantiyon (ppb), ki ka li nan koub kalibrasyon an, miltipliye pa miltip dilution korespondan chak echantiyon swiv, epi yo jwenn konsantrasyon aktyèl echantiyon an.

Pou rediksyon done nan twous ELISA yo, yo te devlope lojisyèl espesyal, ki ka bay sou demann.

11. Sansiblite, presizyon ak presizyon

Tès sansiblite：0.3ppb

Faktè dilution echantiyon siwo myèl: 2

Limit deteksyon

Echantiyon siwo myèl------------------------------------------------ -1ppb

Presizyon

Echantiyon siwo myèl -------------------------------------------- 90±20 %

Presizyon

Varyasyon koyefisyan nan twous ELISA a se mwens pase 10%.

12. Avi

12.1 Valè mwayèn valè absòbe yo jwenn pou estanda yo ak echantiyon yo ap redwi si reyaktif yo ak echantiyon yo pa te reglemante nan tanperati chanm (20-25 ℃).

12.2 Pa kite mikwo-puits yo sèk ant etap pou evite repetisyon san siksè epi opere pwochen etap la imedyatman apre tape detantè mikwo-puits la.

12.3.Omojenize chak reyaktif anvan ou itilize.

12.4.Kenbe po ou lwen solisyon an sispann paske li se 2M H₂SO₄solisyon.

12.5 Pa sèvi ak twous yo demode.Pa fè echanj reyaktif diferan pakèt, paske li pral lage sansiblite a.

12.6 Kondisyon depo:

Kenbe twous ELISA yo nan 2-8 ℃, pa friz.Sele rès plak mikwo-puits Evite limyè solèy dwat pandan tout enkubasyon yo.Li rekòmande kouvri plak mikrotiter yo.

12.7 Endikasyon pou reyaktif yo ap move:

Solisyon substrate yo ta dwe abandone si li vire koulè.

Réactifs yo ka tounen move si valè absorption (450/630nm) nan estanda zewo a se mwens pase 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 Reyaksyon kolorasyon an bezwen 15min apre yo fin ajoute Solisyon A ak Solisyon B. Epi ou ka pwolonje tan enkubasyon an soti nan 20min a plis si koulè a ​​twò limyè pou detèmine.Pa janm depase 25min, Okontrè, diminye tan enkubasyon an byen.

12.9 Tanperati reyaksyon pi bon an se 25 ℃.Tanperati ki pi wo oswa pi ba ap mennen nan chanjman nan valè sansiblite ak absòbe.

13. Depo

Kondisyon depo: 2-8 ℃.

Peryòd depo: 12 mwa.