مصنوعات

ٹیسٹ کا اصول

یہ کٹ بالواسطہ مسابقتی ELISA ٹیکنالوجی پر مبنی ہے۔مائیکرو ٹائٹر کنویں کپلنگ اینٹیجن کے ساتھ لیپت ہیں۔فلوکوئننمونے میں موجود باقیات اینٹی باڈی کے لیے مائکرو ٹائٹر پلیٹ پر لیپت اینٹیجن سے مقابلہ کرتی ہیں۔اینٹی اینٹی باڈی کے لیبل والے انزائم کے اضافے کے بعد، رنگ دکھانے کے لیے TMB سبسٹریٹ استعمال کیا جاتا ہے۔نمونے کے جذب کا منفی طور پر اس میں موجود ٹیٹراسائکلائن سے تعلق ہے، معیاری منحنی خطوط سے موازنہ کرنے کے بعد، ڈیلیشن ملٹیپل سے ضرب کرنے کے بعد، نمونے میں فلومیکوئن کی باقیات کی مقدار کا اندازہ لگایا جا سکتا ہے۔

ایپلی کیشنز

اس کٹ کو شہد میں فلومیکوئن کی باقیات کے مقداری اور معیاری تجزیہ میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔

کراس رد عمل

فلوکوئن ……………………………………………… 100%

مواد کی ضرورت ہے

سازوسامان

┅┅مائکروٹیٹر پلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر (450nm/630nm)

┅┅ ہوموجنائزر یا پیٹ کرنے والا

┅┅شیکر

┅┅ورٹیکس مکسر

┅┅Centrifuge

┅┅تجزیاتی توازن (انڈکٹنس: 0.01 گرام)

┅┅گریجویٹ پائپیٹ: 15 ملی لٹر

┅┅ ربڑ کا پپیٹ بلب

┅┅پولی اسٹیرین سینٹرفیوج ٹیوب: 15 ملی لیٹر، 50 ملی لیٹر

┅┅ گلاس ٹیسٹ ٹیوب: 10 ملی لٹر

┅┅ مائیکروپیپٹس: 20 ملی لٹر-200 ملی لٹر، 100 ملی لٹر -10000 ملی لیٹر،

250 ملی لیٹر - ملٹی پیپیٹ

ری ایجنٹس

┅┅n-hexane(AR)

┅┅میتھیلین کلورائڈ (AR)

┅┅Acetonitrile (AR)

┅┅ڈیونائزڈ پانی

----- مرتکز ہائیڈروکلورک ایسڈ (AR)

کٹ کے اجزاء

● مائکرو ٹائٹر پلیٹ 96 کنویں کے ساتھ اینٹیجن کے ساتھ لیپت

● معیاری حل (6 بوتلیں × 1ml/بوتل)

0ppb، 0.3ppb، 1.2ppb، 4.8ppb، 19.2ppb، 76.8ppb

● اعلی حراستی معیاری کنٹرول: (1ml/بوتل)

…………………………………………………………100ppb

● انزائم کنجوگیٹ 12 ملی لیٹر………………………... سرخ ٹوپی

● اینٹی باڈی محلول 7 ملی لیٹر …………………………………..گرین ٹوپی

● حل A 7 ملی لیٹر ……………………………………….. سفید ٹوپی

● حل B 7 ملی لیٹر …………………………………………… سرخ ٹوپی

● سٹاپ سلوشن 7 ملی لیٹر ……………………………… پیلی ٹوپی

● 20XConcentrated واش حل 40ml

……………………………………………….. شفاف ٹوپی

●2X نکالنے کا محلول 50ml………………………… نیلی ٹوپی

ری ایجنٹس کی تیاری

7.1 شہد کا نمونہ

حل 1 : 0.2 ایم ہائیڈروکلورک ایسڈ محلول

وزن 41.5 ملی لیٹر مرتکز ہائیڈروکلورک ایسڈ، ڈیونائزڈ پانی سے 500 ملی لیٹر تک پتلا کریں۔

حل 2: حل دھوئے۔

1:19 کے حجم کے تناسب میں ڈیونائزڈ پانی کے ساتھ مرتکز واش محلول کو پتلا کریں، جو پلیٹوں کو دھونے کے لیے استعمال کیا جائے گا۔پتلا محلول 4℃ پر 1 ماہ کے لیے محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

حل3: نکالنے کا حل

1:1 (یا ضرورت پر منحصر ہے) کے حجم کے راشن میں ڈیونائزڈ پانی کے ساتھ 2×مرتکز نکالنے والے محلول کو پتلا کریں، جو نمونہ نکالنے کے لیے استعمال کیا جائے گا۔یہ پتلا محلول 4℃ پر 1 ماہ کے لیے محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

نمونے کی تیاری

8.1 آپریشن سے پہلے صارفین کے لیے نوٹس اور احتیاطی تدابیر

(a) براہ کرم تجربے کے عمل میں یک طرفہ ٹپس استعمال کریں، اور مختلف ریجنٹ جذب کرتے وقت ٹپس کو تبدیل کریں۔

(b) یقینی بنائیں کہ تمام تجرباتی آلات صاف ہیں، بصورت دیگر یہ پرکھ کے نتائج کو متاثر کرے گا۔

8.2شہد کا نمونہ

----- 2g±0.05g شہد کے نمونے کا وزن 50ml پولی اسٹیرین سینٹری فیوج ٹیوب میں کریں،

----- 2 ملی لیٹر 0.2 ایم ہائیڈرو کلورک ایسڈ محلول (حل 1) شامل کریں، اسے مکمل طور پر مکس کرنے کے لیے ورٹیکس، پھر 8 ملی لیٹر میتھیلین کلورائیڈ شامل کریں، مکمل طور پر تحلیل ہونے کے لیے 5 منٹ تک شیکر سے ہلائیں۔

-----10 منٹ کے لیے سینٹرفیوج، کمرے کے درجہ حرارت پر کم از کم 3000 گرام (20-25℃)؛

-----سپرناٹینٹ فیز کو ہٹا دیں، 2 ملی لیٹر سبسٹریٹ نامیاتی محلول کو 10 ملی لیٹر گلاس ٹیوب میں لے جائیں۔ سب سٹیٹ کو نائٹروجن کے بہاؤ کے پانی کے غسل کے نیچے خشک کریں (50-60℃)

----- 1 ملی لٹر n-ہیکسین شامل کریں، 30s کے لیے ورٹیکس، پھر 1 ملی لیٹر نکالنے کا حل (حل 3) شامل کریں، 1 منٹ کے لیے دوبارہ بھنور ڈالیں۔5 منٹ کے لیے سینٹرفیوج، کمرے کے درجہ حرارت پر کم از کم 3000 گرام (20-25℃)؛

----- سپرنٹنٹ مرحلے کو ہٹا دیں، پرکھ کے لیے 50 ملی لیٹر لیں؛

9. پرکھ کا عمل

9.1 پرکھ سے پہلے نوٹس

9.1.1 یقینی بنائیں کہ تمام ریجنٹس اور مائیکرو ویل کمرے کے درجہ حرارت پر ہیں (20-25℃)۔

9.1.2 استعمال کے فوراً بعد باقی تمام ریجنٹس کو 2-8℃ پر واپس کریں۔

9.1.3 مائیکرو ویلز کو صحیح طریقے سے دھونا پرکھ کے عمل میں ایک اہم مرحلہ ہے۔یہ ELISA تجزیہ کی تکرار کا ایک اہم عنصر ہے۔

9.1.4 روشنی سے بچیں اور انکیوبیشن کے دوران مائیکرو ویلز کو ڈھانپیں۔

9.2 پرکھ کے مراحل

9.2.1 تمام ری ایجنٹس کو کمرے کے درجہ حرارت (20-25℃) پر 30 منٹ سے زیادہ کے لیے نکالیں، استعمال سے پہلے ہم آہنگ کریں۔

9.2.2 ضروری مائیکرو ویل نکالیں اور باقی کو فوری طور پر 2-8℃ پر زپ لاک بیگ میں واپس کریں۔

9.2.3 استعمال سے پہلے دھونے کے حل کو کمرے کے درجہ حرارت پر دوبارہ گرم کیا جانا چاہیے۔

9.2.4نمبر:ہر مائیکرو ویل پوزیشن کو نمبر دیں اور تمام معیارات اور نمونے ڈپلیکیٹ میں چلائے جائیں۔معیارات اور نمونے کی پوزیشنیں ریکارڈ کریں۔

9.2.5معیاری حل/نمونہ شامل کریں:50 µl معیاری محلول یا تیار شدہ نمونہ متعلقہ کنوؤں میں شامل کریں۔50µl اینٹی باڈی حل شامل کریں۔پلیٹ کو دستی طور پر ہلاتے ہوئے ہلکے سے مکس کریں اور 25℃ پر 30 منٹ تک کور کے ساتھ سینکیں۔

9.2.6دھونا:ڈھکن کو آہستہ سے ہٹائیں اور کنوؤں سے مائع کو صاف کریں اور مائکرو ویلز کو 250µl 10 سیکنڈ کے وقفے سے 250µl ڈائلٹ واش سلوشن (حل 2) سے 4-5 بار دھو لیں۔جاذب کاغذ کے ساتھ بقایا پانی کو جذب کریں (باقی ہوا کے بلبلے کو غیر استعمال شدہ نوک سے ختم کیا جا سکتا ہے)۔

9.2.8انزائم کنجوگیٹ:ہر کنویں میں انزائم کنجوگیٹ محلول 100 ملی لیٹر شامل کریں، پلیٹ کو دستی طور پر ہلاتے ہوئے آہستہ سے مکس کریں اور 25 ℃ پر 30 منٹ تک ڈھانپ کر سینکیں۔دوبارہ دھونے کا مرحلہ دہرائیں۔

9.2.8رنگت:ہر کنویں میں 50µl محلول A اور 50µl محلول B شامل کریں۔پلیٹ کو دستی طور پر ہلاتے ہوئے ہلکے سے مکس کریں اور 15 منٹ تک 25℃ پر کور کے ساتھ انکیوبیٹ کریں (12.8 دیکھیں)۔

9.2.9پیمائش:ہر کنویں میں 50µl سٹاپ محلول شامل کریں۔پلیٹ کو دستی طور پر ہلاتے ہوئے آہستہ سے مکس کریں اور جاذبیت کو 450nm پر ایک ہوا خالی کے خلاف پیمائش کریں (یہ 450/630nm کی دوہری طول موج کے ساتھ تجویز کیا گیا ہے۔ سٹاپ سلوشن شامل کرنے کے بعد 5 منٹ کے اندر نتیجہ پڑھیں۔) (ہم نظر سے بھی پیمائش کر سکتے ہیں۔ ELIASA آلہ کے مختصر میں اسٹاپ حل کے بغیر)

نتائج

10.1 فیصد جذب

معیارات اور نمونوں کے لیے حاصل کردہ جاذب قدروں کی اوسط قدروں کو پہلے معیار (صفر معیاری) کی جاذب قدر سے تقسیم کیا جاتا ہے اور 100% سے ضرب کیا جاتا ہے۔اس طرح صفر کے معیار کو 100% کے برابر بنایا جاتا ہے اور جاذبیت کی قدریں فیصد میں بتائی جاتی ہیں۔

جذب (%) = B/B0 × 100%

بی ——جذب کا معیار (یا نمونہ)

B0 —— جذب صفر معیار

10.2 معیاری وکر

معیاری منحنی خطوط کھینچنے کے لیے: معیارات کی جاذبیت قدر کو y-axis کے طور پر لیں، flumequine اسٹینڈرڈز سلوشن (ppb) کے ارتکاز کا نیم لوگاریتھمک x-axis کے طور پر۔

--- دیflumeequineہر ایک نمونے (ppb) کا ارتکاز، جسے انشانکن وکر سے پڑھا جا سکتا ہے، اس کے بعد آنے والے ہر نمونے کے متعلقہ کمزوری سے ضرب کیا جاتا ہے، اور نمونے کا اصل ارتکاز حاصل کیا جاتا ہے۔

ELISA کٹس کے ڈیٹا میں کمی کے لیے، خصوصی سافٹ ویئر تیار کیا گیا ہے، جو درخواست پر فراہم کیا جا سکتا ہے۔

11. حساسیت، درستگی اور درستگی

ٹیسٹ حساسیت：0.3ppb

شہد کا نمونہ کم کرنے کا عنصر: 2

پتہ لگانے کی حد

شہد کا نمونہ ---------------------------------- -1ppb

درستگی

شہد کا نمونہ ------------------------------------------------------- 90±20 %

صحت سے متعلق

ELISA کٹ کا تغیر گتانک 10% سے کم ہے۔

12. نوٹس

12.1 معیارات اور نمونوں کے لیے حاصل کردہ جاذبیت کی اوسط قدریں کم ہو جائیں گی اگر ری ایجنٹس اور نمونوں کو کمرے کے درجہ حرارت (20-25℃) پر ریگولیٹ نہیں کیا گیا ہے۔

12.2 ناکام تکرار سے بچنے کے لیے مراحل کے درمیان مائیکرو ویلز کو خشک نہ ہونے دیں اور مائیکرو ویلز ہولڈر کو تھپتھپانے کے فوراً بعد اگلا مرحلہ چلائیں۔

12.3.استعمال کرنے سے پہلے ہر ریجنٹ کو ہم آہنگ کریں۔

12.4.اپنی جلد کو سٹاپ سلوشن سے دور رکھیں کیونکہ یہ 2M H ہے۔₂SO₄حل

12.5 پرانی کٹس کا استعمال نہ کریں۔مختلف بیچوں کے ری ایجنٹس کا تبادلہ نہ کریں، کیونکہ اس سے حساسیت ختم ہو جائے گی۔

12.6 اسٹوریج کی حالت:

ELISA کٹس کو 2-8℃ پر رکھیں، منجمد نہ کریں۔مائیکرو ویل پلیٹوں کو سیل کریں تمام انکیوبیشن کے دوران سیدھی سورج کی روشنی سے گریز کریں۔مائکرو ٹائٹر پلیٹوں کو ڈھانپنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

12.7 ری ایجنٹس کے خراب ہونے کے اشارے:

اگر رنگ بدل جائے تو سبسٹریٹ محلول کو ترک کر دینا چاہیے۔

اگر صفر معیار کی جاذبیت کی قدر (450/630nm) 0.5 (A450nm＜0.5) سے کم ہو تو ریجنٹس خراب ہو سکتے ہیں۔

12.8 حل A اور حل B کو شامل کرنے کے بعد رنگین رد عمل کو 15 منٹ درکار ہوتے ہیں۔ اور اگر رنگ بہت ہلکا ہے تو آپ انکیوبیشن کے وقت کو 20 منٹ سے زیادہ بڑھا سکتے ہیں۔کبھی بھی 25 منٹ سے زیادہ نہ ہوں، اس کے برعکس، انکیوبیشن کے وقت کو صحیح طریقے سے کم کریں۔

12.9 بہترین رد عمل کا درجہ حرارت 25 ℃ ہے۔زیادہ یا کم درجہ حرارت حساسیت اور جاذبیت کی قدروں میں تبدیلی کا باعث بنے گا۔

13. ذخیرہ

سٹوریج کی حالت: 2-8℃

ذخیرہ کرنے کی مدت: 12 ماہ۔